Shrnutí: Současná nová léčiva se z pohledu chromatografie vyznačují řadou výzev, ať už je to detekce nebo rozlišení od koelujících nečistot, nicméně největší překážkou bývá retence a rozlišení polárních sloučenin, které nejsou vhodné pro typické podmínky reverzní fáze C18.
Mnoho tradičních stacionárních fází HPLC s reverzní fází neposkytuje dostatečnou retenci pro mnohé ze stále se zvyšujícího počtu polárních sloučenin analyzovaných pomocí HPLC. Tyto sloučeniny jsou často buď nezachyceny nebo je jejich retence nedostačující a tudíž je narušen tvar píku či koelují s jinými analyty se slabou retencí. Slabě zadržované analyty eluují v oblasti iontové suprese, což způsobuje problémy v rámci LC-MS analýzy.
Tento technický tip představuje HILIC jako alternativní možnost, která je účinná zejména pro LC-MS. HILIC používá k eluci polárních sloučenin vysoké hladiny organického rozpouštědla, což pomáhá zlepšit jejich ionizační účinnost během LC-MS.
Tip: HILIC funguje tak, že zadržuje polární sloučeniny ve vodní vrstvě, která se tvoří na povrchu silika částic (obr.1)
Acetonitril (MeCN) je slabé rozpouštědlo používané v HILIC a amonný pufr je rozpouštědlo silné. Amonné soli jsou zásadní jako protiionty usnadňující tvorbu dvojvrstvy důležitou pro separaci, která je znázorněna na obr. 1.
Polární stacionární fáze přitahuje vodní vrstvu čímž podporuje retenci polárních sloučenin. Polární sloučeniny se eluují se zvyšujícím se množstvím vody, což narušuje retenci polárních analytů k polární stacionární fázi, nezbytné k vyvolání eluce.
Je důležité před použitím HILIC kolonu prvně ekvilibrovat, abychom zajistili dostačný čas k vytovření vodní vrstvy. Pokud nedojde k její tvorbě, tak retence bude nekonzistentí a metoda nebude dostatečně robustní.
Zmínili jsme použití amonných pufrů, ale v rámci metody HILIC však existuje několik dalších faktorů, které jsou stejně zásadní pro její úspěch.
První je selektivita, pro kterou je klíčová spravná volba kolony. Stejně jako u kolon s reverzní fází existuje pro HILIC mnoho různých stacionárních fází a každá z nich se vyznačuje různou selektivitou a dalšími benefity. Doporučujeme Vám vždy prověřit 3 různé fáze, abyste se ujistili, která nabízí nejlepší selektivitu pro Vaši aplikaci.
Mezi HILIC stacionární fáze, které byste mohli zvážit, patří:
Pokud jde o mobilní fázi, je důležité použít MeCN jako organickou složku - protická rozpouštědla, jako je methanol, mohou narušit dvouvrstvou formaci, o které jsme mluvili. Důležité je také množství organické složky, jejiž příliš vysoké procento v počátečním gradientovém bodě zkomplikuje a prodlouží ekvilibraci dvouvrstvy; 90% organické složky je pro začátek ideální.
Pokud je to možné, tak gradientový profil by měl být 90% MeCN - 50%. Tímto způsobem lze zajistit plnou ekvilibraci na začátku gradientu. Pokud jsou k eluci sloučeniny vyžadovány podmínky větší než 50% pufru, bude lepší volbou polární typ C18 stacionární fáze, nikoliv HILIC. Po každém gradientu je nutná ekvilibrace dvouvrstvy. Čím vyšší je procento pufru na konci gradientu, tím delší bude proces ekvilibrace. Nedostatečná ekvilibrace bude mít za následek zhoršenou reprodukovatelnost a metoda nebude dostatečně robustní.
Posledním parametrem, který je potřeba vzít v úvahu, je pH. Měly by být testovány nejméně 2 různé hodnoty pH. Obvykle se doporučuje pH 3.2 s použitím mravenčanu amonného a 5.8 s použitím acetátu amonného. Různé hodnoty pH mohou vést k výrazně odlišným selektivitám (obr. 2).
Zásadní rozdíly v eluci v závislosti na typu mobilní a stacionární fázi.
HILIC je mimořádně užitečný nástroj pro zlepšení retence polárních sloučenin. Tato technika patří k náročnějším pokud jde o robustnost metody, nicméně pečlivá volba mobilní fáze a parametrů metody může vést k úspěšným separacím i náročnějších sloučenin.