Zrozumienie pojęcia „współczynnik retencji” może zmniejszyć problemy i prowadzić do poprawy stabilności metod analitycznych.
Patrząc na dane wygenerowane z analizy HPLC, naturalnym jest skupianie się na czasach retencji, asymetrii pików i sprawności. Parametry te pozwalają analitykowi na identyfikację i ocenę ilościową związków, a im dokładniejsze są te informacje, tym większa pewność co do identyczności piku i stężenia analitu.
Współczynnik retencji jest często pomijanym parametrem analitycznym, ale gdy jest właściwie wykorzystywany, może umożliwiać opracowanie niezawodnej metodologii. Współczynnik retencji służy do optymalizacji czasów retencji analitów w stosunku do wymiarów kolumny analitycznej i jest zdefiniowany jako:
K’ = tr-t0/t0
Gdzie tr oznacza czas retencji analitu, a t0 czas retencji związku nie zatrzymywanego. Znaczenie współczynnika retencji zilustrowaliśmy na poniższym przykładzie:
| 1. | Kwas szczawiowy |
| 2. | Kwas winowy |
| 3. | Kwas glikolowy |
| 4. | Kwas mrówkowy |
| 5. | Kwas pirogronowy |
| 6. | Kwas malonowy |
| 7. | Kwas octowy |
| 8. | Kwas maleinowy |
| 9. | Kwas cytrynowy |
Powyżej mamy analizę kwasów organicznych przeprowadzoną na kolumnie C18, stabilnej w 100% wodnych warunkach. Faza ruchoma to 20 mM bufor fosforanowy o pH 2,9, a prędkość przepływu eluenta to 0,7 ml/min. Na pierwszy rzut oka kwas szczawiowy jest zatrzymywany przez prawie 4 minuty, ale po dokładniejszym przyjrzeniu się widzimy, że t0 dla tej kolumny wynosi około 3,7 minuty. A zatem kwas szczawiowy, jako bardzo polarny wiązek, jest w bardzo małym stopniu zatrzymywany na złożu.
K’ = 3.9-3.7/3.7 = 0.054
Wskazuje to, że stopień oddziaływania tego kwasu z fazą stacjonarną jest bardzo niski. W takich przypadkach na retencję analitu duży wpływ mogą mieć nawet małe zmiany parametrów, takich jak:
- Skład fazy ruchomej
- pH fazy ruchomej
- Siła rozpuszczalnika próbki
- Temperatura
Dlatego jest mało prawdopodobne, aby taka metoda była solidna i powtarzalna, z retencją kwasu szczawiowego zmieniającą się z analizy na analizę, z kolumny na kolumnę i od jednej partii fazy ruchomej do drugiej.
Dobrą praktyką jest, aby opracowywane metody analityczne uwzględniały ten parametr i aby współczynniki retencji zawierały się w przedziale 2-10. Widzieliśmy potencjalne problemy związane ze współczynnikami mniejszymi niż 2, ale dlaczego poprzestać na współczynniku retencji nie większym niż 10?
Podczas analiz w warunkach izokratycznych szerokość piku wzrasta wraz ze wzrostem czasu retencji z powodu dyfuzji. Chociaż zastosowanie kolumn z mniejszym ziarnem i optymalnych prędkości przepływu pomoże zmniejszyć tę dyfuzję, nie można jednak jej wyeliminować. Dodatkowo, wysokie współczynniki retencji ostatecznie skutkują długimi czasami analiz, które są generalnie niepożądane w produktywnym środowisku laboratoryjnym.
| 1. | Hydrokortyzon |
| 2. | Kortykosteron |
| 3. | 11-a-hydroksyprogesteron |
| 4. | Octan kortyzonu |
| 5. | 11-ketoprogesteron |
Powyżej przedstawiamy przykład analizy steroidów prowadzonej na kolumnie o wymiarach 150 x 4,6 mm przy przepływie 1 ml/min. 11-Ketoprogesteron eluuje w około 17,5 min, z współczynnikiem retencji około 10,6. W tych warunkach poszerzenie piku jest wyraźnie widoczne, co wskazuje, że ostatni eluujący związek jest zatrzymywany w kolumnie przez zbyt długi czas.
Zrozumienie wytycznych (współczynniki retencji od 2 do 10) jest pomocne, ale pozostawia nam pytanie, jak można je dostosować?
Współczynnik retencji jest odwrotnie proporcjonalny do siły eluotropowej fazy ruchomej. Wyższa siła elucyjna rozpuszczalnika obniży współczynnik retencji i odwrotnie. Gdy współczynników retencji nie można zwiększyć przez zmniejszenie siły elucyjnej fazy ruchomej, może być konieczna zmiana typu fazy stacjonarnej kolumny na taką, która zapewni większą retencję analitów, na przykład przez zastosowanie bardziej polarnej fazy stacjonarnej dla analitów polarnych.
