Comprender el factor de capacidad puede reducir los problemas y conducir al desarrollo de métodos más estables.
Cuando se observan los datos generados en el análisis por HPLC, es natural centrarse en el tiempo de retención, la asimetría de los picos y la eficacia. Estos parámetros permitirán al usuario identificar y cuantificar los analitos; cuanto más precisa sea esta información, mayor será la confianza en la identidad de los picos y la concentración de analitos.
El factor de capacidad es a menudo un parámetro de las separaciones que se pasa por alto, pero cuando se utiliza correctamente puede guiar al usuario para producir una metodología más sólida. El factor de capacidad sirve para normalizar el tiempo de retención de un analito a las dimensiones de la columna analítica, y se define como:
K’ = tr-t0/t0
Donde tr es el tiempo de retención del analito, y t0 el tiempo de elución de un compuesto no retenido. La importancia del factor de capacidad puede ilustrarse mejor con un ejemplo:
| 1. | Ácido oxálico |
| 2. | Ácido tartárico |
| 3. | Ácido glicólico |
| 4. | Ácido fórmico |
| 5. | Ácido pirúvico |
| 6. | Ácido malónico |
| 7. | Ácido acético |
| 8. | Ácido maleico |
| 9. | Ácido cítrico |
Aquí tenemos una separación de ácidos orgánicos, llevada a cabo en una columna C18 que es estable a condiciones 100% acuosas. La fase móvil es un tampón de fosfato de potasio 20 mM a pH 2,9, con un caudal de 0,7 ml/min. A primera vista, el ácido oxálico se retiene en casi 4 minutos, pero si se examina con más detenimiento, el tiempo de retención t0 de esta columna es de aproximadamente 3,7 minutos. Cuando se considera esto, queda claro que el ácido oxálico, un diácido muy polar, apenas es retenido por la columna.
K’ = 3,9-3,7/3,7 = 0,054
Esto indica que el ácido oxálico no pasa casi ningún tiempo asociado a la fase estacionaria durante su tránsito por la columna. En estos casos, la retención del analito se verá muy influenciada por pequeños cambios no intencionados en los parámetros, entre ellos:
- Composición de la fase móvil
- El pH de la fase móvil
- Fuerza del diluyente de la muestra
- Temperatura
Por lo tanto, es poco probable que un método de este tipo sea robusto, ya que la retención del ácido oxálico varía de un análisis a otro, de una columna a otra y de un lote de fase móvil a otro.
Esto lleva a recomendar, siempre que se desarrollen métodos, que los factores de capacidad se sitúen en el rango de 2-10. Hemos visto el potencial de problemas con factores de capacidad inferiores a 2, pero ¿por qué detenerse en un factor de capacidad de 10?
Durante un análisis en isocrático, la anchura de los picos aumenta con el incremento del tiempo de retención debido a la difusión. Aunque el uso de columnas de partículas más pequeñas y de caudales óptimos ayudará a reducir esta difusión, no puede eliminarse. Además, los factores de capacidad elevados acaban dando lugar a tiempos de análisis largos, que generalmente no son deseables en un entorno de laboratorio productivo.
| 1. | Hidrocortisona |
| 2. | Corticosterona |
| 3. | 11-a-Hidroxiprogesterona |
| 4. | Acetato de cortisona |
| 5. | 11-Cetoprogesterona |
Aquí tenemos un ejemplo de esteroides analizados en una columna de 150 x 4,6 mm a 1 ml/min. La 11-etoprogesterona eluye a unos 17,5 minutos, con un factor de capacidad de aproximadamente 10,6. El ensanchamiento de los picos es evidente en esta corrida isocrática, lo que indica que el último pico de elución está siendo retenido en la columna por un período de tiempo excesivo.
La comprensión de la directriz (factores de capacidad de entre 2 y 10) es útil, pero nos deja con la pregunta de cómo se pueden ajustar.
El factor de capacidad está inversamente relacionado con la fuerza elutrópica de la fase móvil. Una mayor resistencia elutrópica reducirá el factor de capacidad, y viceversa. Cuando los factores de capacidad bajos no pueden aumentarse reduciendo la fuerza elutrópica de la fase móvil, puede ser necesario cambiar a una fase estacionaria que pueda ofrecer una mayor retención de los analitos, por ejemplo, utilizando una fase estacionaria más polar para los analitos polares.
