Shrnutí: Současná nová léčiva se z pohledu chromatografie vyznačují řadou výzev, ať už je to detekce nebo rozlišení od koelujících nečistot, nicméně největší překážkou bývá retence a rozlišení polárních sloučenin, které nejsou vhodné pro typické podmínky reverzní fáze C18.

Mnoho tradičních stacionárních fází HPLC s reverzní fází neposkytuje dostatečnou retenci pro mnohé ze stále se zvyšujícího počtu polárních sloučenin analyzovaných pomocí HPLC. Tyto sloučeniny jsou často buď nezachyceny nebo je jejich retence nedostačující a tudíž je narušen tvar píku či koelují s jinými analyty se slabou retencí. Slabě zadržované analyty eluují v oblasti iontové suprese, což způsobuje problémy v rámci LC-MS analýzy.

Tento technický tip představuje HILIC jako alternativní možnost, která je účinná zejména pro LC-MS. HILIC používá k eluci polárních sloučenin vysoké hladiny organického rozpouštědla, což pomáhá zlepšit jejich ionizační účinnost během LC-MS.

Tip: HILIC funguje tak, že zadržuje polární sloučeniny ve vodní vrstvě, která se tvoří na povrchu silika částic (obr.1)

Acetonitril (MeCN) je slabé rozpouštědlo používané v HILIC a amonný pufr je rozpouštědlo silné. Amonné soli jsou zásadní jako protiionty usnadňující tvorbu dvojvrstvy důležitou pro separaci, která je znázorněna na obr. 1.

Polární stacionární fáze přitahuje vodní vrstvu čímž podporuje retenci polárních sloučenin. Polární sloučeniny se eluují se zvyšujícím se množstvím vody, což narušuje retenci polárních analytů k polární stacionární fázi, nezbytné k vyvolání eluce.

Je důležité před použitím HILIC kolonu prvně ekvilibrovat, abychom zajistili dostačný čas k vytovření vodní vrstvy. Pokud nedojde k její tvorbě, tak retence bude nekonzistentí a metoda nebude dostatečně robustní.

Zmínili jsme použití amonných pufrů, ale v rámci metody HILIC však existuje několik dalších faktorů, které jsou stejně zásadní pro její úspěch.

První je selektivita, pro kterou je klíčová spravná volba kolony. Stejně jako u kolon s reverzní fází existuje pro HILIC mnoho různých stacionárních fází a každá z nich se vyznačuje různou selektivitou a dalšími benefity. Doporučujeme Vám vždy prověřit 3 různé fáze, abyste se ujistili, která nabízí nejlepší selektivitu pro Vaši aplikaci.

Mezi HILIC stacionární fáze, které byste mohli zvážit, patří:

Pokud jde o mobilní fázi, je důležité použít MeCN jako organickou složku - protická rozpouštědla, jako je methanol, mohou narušit dvouvrstvou formaci, o které jsme mluvili. Důležité je také množství organické složky, jejiž příliš vysoké procento v počátečním gradientovém bodě zkomplikuje a prodlouží ekvilibraci dvouvrstvy; 90% organické složky je pro začátek ideální.

Pokud je to možné, tak gradientový profil by měl být 90% MeCN - 50%. Tímto způsobem lze zajistit plnou ekvilibraci na začátku gradientu. Pokud jsou k eluci sloučeniny vyžadovány podmínky větší než 50% pufru, bude lepší volbou polární typ C18 stacionární fáze, nikoliv HILIC. Po každém gradientu je nutná ekvilibrace dvouvrstvy. Čím vyšší je procento pufru na konci gradientu, tím delší bude proces ekvilibrace. Nedostatečná ekvilibrace bude mít za následek zhoršenou reprodukovatelnost a metoda nebude dostatečně robustní.

Posledním parametrem, který je potřeba vzít v úvahu, je pH. Měly by být testovány nejméně 2 různé hodnoty pH. Obvykle se doporučuje pH 3.2 s použitím mravenčanu amonného a 5.8 s použitím acetátu amonného. Různé hodnoty pH mohou vést k výrazně odlišným selektivitám (obr. 2).

HILIC je mimořádně užitečný nástroj pro zlepšení retence polárních sloučenin. Tato technika patří k náročnějším pokud jde o robustnost metody, nicméně pečlivá volba mobilní fáze a parametrů metody může vést k úspěšným separacím i náročnějších sloučenin.

Plynová chromatografie je vynikající technika, pomocí které lze dosáhnout mimořádně ostrých píků a rozlišení v rámci komplexní směsi analytů, každý analyt však musí být těkavý, aby se usnadnila GC analýza. Derivatizace umožňuje analyzovat látky, které jsou jinak obtížně těkavé. Do této skupiny patří nejen kyseliny a zásady, ale také vysoce vroucí neutrální analyty, které mají velké množství polárních substituentů, jako jsou steroly a malé cukry. Silylace je oblíbeným nástrojem derivatizace vysoce polárních analytů pro usnadnění GC analýzy.

Silylační činidla jsou jednoduché prostředky k derivatizaci široké škály analytů, nejčastěji cukrů, fenolů, slabých kyselin, aminů, amidů a thiolů. Silylační činidlo obecně nahradí „aktivní“ vodík polární funkční skupiny nepolární TMS (trimethylsilanovou) skupinou. Výsledný TMS derivát cíleného analytu bude mít nižší polaritu a nižší teplotu varu (konkrétně vyšší tlak par). Výsledný derivát bude snadněji těkat a bude možné použít širokou škálu stacionárních fází GC.

TMSI (N-trimethylsilylimidazol) je často používaným činidlem pro zacílení na hydroxylové skupiny a karboxylové kyseliny, pro které je odštěpující se skupina imidazolu vhodná k zachycení aktivního vodíku. TMSI může také cílit na fenoly a thioly. Silylační činidla BSA a BSTFA mají silnější odstupující skupiny, což umožňuje těmto činidlům kromě analytů cílených TMSI také derivatizovat aminy, amidy a aminokyseliny. Běžná silylační činidla jsou vhodná pro„aktivní“ vodíky, které nejsou stéricky bráněny. TMCS (také TMS-Cl) je derivatizační činidlo, které může být přidáno jako katalyzátor dalších silylačních činidel pro zlepšení derivace stericky bráněných skupin. TMSC se většinou nepoužívá samostatně během derivatizace GC vzorků.

Katalyzátory a polární aprotická rozpouštědla se často používají ke zvýšení citlivosti cíleného „aktivního“ vodíku k nahrazení skupinou TMS, jako je použití pyridinu k odštěpení aktivního vodíku z fenolu. Silylační reakce se často provádějí buď „čisté“ nebo v aprotickém rozpouštědle (organická rozpouštědla, která neobsahují žádné hydroxylové skupiny). Protická rozpouštědla (obvykle alkoholy nebo voda) budou reagovat se silylačním činidlem.

Vyvarujte se GC stacionárním fázím, které obsahují hydroxylové skupiny jako například fáze „WAX“, neboť ty budou reagovat s jakýmkoliv nevyužitím silylačním činidlem a zároveň mohou reagovat se samotnými silylovanými analyty. Pro analýzu silylovaných analytů se doporučují fáze s nízkou polaritou a mírně polární fáze na bázi siloxanu. Pokud jde o péči o váš GC přístroj, pamatujte na těkavost vedlejšího produktu, který vzniká odštěpením skupiny silylačního činidla při přípravě GC vzorku. Imidazol (vedlejší produkt z TMSI) je aktivní báze a má atmosférickou teplotu varu 256 °C, zatímco N-methyltrifluoracetamid (vedlejší produkt z MSTFA) je neutrální amid, který má teplotu varu 156 °C. Bez ohledu na silylační činidlo vyměňte inlet liner a ořízněte prvních pár centimetrů GC kolony, jakmile se sníží citlivost a píky začnou chvostovat.

LC hadičky je možné vyrobit z několika různých typů materiálů dle potřeb konkrétní laboratoře. Mezi nejpoužívanější materiály patří PEEK, Stainless Steel, PEEKsil a PEEK-Lined Stainless Steel. Každý materiál má odlišné vlastnosti s ohledem na typ vzorku či kapaliny a také specifickou flexibilitu, která se vztahuje ke konkrétnímu materiálu. Hadičky se snadno poškodí, pokud se příliš často ohýbají. Následně může stěna hadičky zeslábnout, což často vede k netěsnosti. Netěsné spojení může negativně ovlivnit výsledky analýz a musí být nahrazeno.

Aby nedošlo k přetržení hadičky, je důležité ji udržovat nad poloměrem ohybu specifickým pro konkrétní materiál. Níže uvádíme obrázek typického nastavení LC, který Vám pomůže si představit, co je „poloměrem ohybu“ myšleno. Žlutý kruh byl nakreslen pro ilustraci kritického ohybu. Poloměr kruhu je žlutě označená čára „r“. Hodnota „r“ je proměnná, měnící se dle materiálu hadičky. Dva červené kruhy ilustrují problematický poloměr ohybu. Na první pohled vypadají příliš těsně a měly by být přeměřeny, aby se potvrdilo, že ohyb není pod přípustnou specifikací.

Přímé spoje Phenomenex SecurityLINK™ s nulovým mrtvým objemem se dodávají ve třech různých typech materiálů hadiček: PEEKsil, PEEK-Lined Stainless Steel a Stainless Steel. V tabulce 1 jsou uvedeny jednotlivé materiály a jejich specifický poloměr ohybu. PEEKsil materiál má poloměr ohybu 1,00“ ve srovnání s poloměrem 0,25” u ostatních dvou materiálů. Hadičky PEEKsil jsou vyrobeny z PEEK materiálu s vnitřní vrstvou ze skla. Díky vnitřní vrstvě skla nelze hadičku ohýbat natolik jako Stainless Steel nebo PEEK-Lined Stainless Steel.

Protože k netěsnostem může dojít zejména při příliš malém poloměru ohybu, mělo by řešení problémů zahrnovat měření poloměru ohybu netěsnící hadičky. Je-li ohnutí menší než je nejvetší povolený poloměr ohybu konkrétního materiálu, je možné zvážit dvě potenciální řešení. První možností je volba alternativního materiálu, aby byl umožněn menší nebo těsnější poloměr ohybu. Druhým řešením je zvolit delší hadičku ze stejného materiálu, což by umonžilo větší poloměr ohybu. Druhá možnost závisí na tom, zda bude v LC přístroji prostor pro delší hadičku.