Astuces techniques sur la préparation d’échantillon
Niveau : Intermédiaire
Préparation d'échantillons pour les N-glycanes
Utilisation d'une plaque de préparation d'échantillons pour le nettoyage des N-glycanes clivés des glycoprotéines
Les plaques de préparation d'échantillons se sont avérées efficaces pour remplacer les processus de préparation d'échantillons plus intensifs qui suivent le clivage du glycane des glycoprotéines par la digestion à la PNGase F. Il est essentiel de marquer les N-glycanes avant de les quantifier par HPLC-UV ou LC-MS/MS et les méthodes de nettoyage plus traditionnelles prennent du temps et comportent de multiples étapes qui peuvent favoriser les erreurs. Le nettoyage à l'aide d'un produit d'extraction en phase solide (SPE) HILIC, tel que les plaques de microélution BiozenTM-N-Glycan, offre des résultats sensibles, efficaces et rapides et nous décrivons ci-dessous le déroulement des étapes pour les glycanes.
Les échantillons de glycoprotéines sont reconstitués à 2 mg/ml avec de l'eau pure et sont dénaturés en ajoutant 6 µl d'agent tensioactif et en chauffant à 90°C pendant 3 minutes. Ensuite on ajoute 1,2 µl de PNGase F et on incube les échantillons pendant 5 minutes à 50 °C.
Cette étape sert à séparer les glycanes de leur glycoprotéine
Le marquage est ensuite effectué à l'aide de l'acide 2-aminoacétique (2-AA) ou de l'acide 2-aminobenzoïque (2-AB) en utilisant les glycanes libérés qui sont préparés avec 12 μl de solution de réactif de marquage par échantillon et incubés pendant 5 minutes à température ambiante.
Après le marquage fluorescent, le colorant doit être éliminé car il est en excès, comme c'est le cas dans toute étape de dérivatisation. Pour cela, il est préférable d'utiliser une plaque HILIC SPE.
Le nettoyage est ensuite effectué à l'aide de la plaque HILIC SPE selon la procédure suivante:
| Plaques 96 puits | Nettoyage Biozen N-Glycan |
|---|---|
| Conditionner | 200µl d'eau |
| Équilibrer | 200µl d'eau /ACN (15:85) |
| Charger | Échantillon |
| Laver | 2 x 600µl d'acide formique / eau / ACN (1:9:90) |
| Éluer | 3 x 30 µl d'acétate d'ammonium 200mM dans ACN/eau (5:95) |
| Diluer | 100 µl Diméthylformamide et 210 µl ACN |
Cette étape permet d'éluer les glycanes dans un tampon aqueux. Cependant la technique de séparation HPLC généralement utilisée ensuite est HILIC et un diluant aqueux constituerait un solvant trop fort pour une méthode HILIC, ce qui fait que cette technique n'est pas idéale. Pour cette raison, les plaques de microélution sont la plate-forme préférée pour le nettoyage afin de minimiser la quantité de tampon aqueux dans l'échantillon et de réduire l'effet de solvant fort pour l'analyse. Lorsqu'ils sont préparés de cette manière, ces échantillons de glycanes marqués sont prêts à être analysés à l'aide d'une colonne d'analyse de glycanes.
Nettoyage des échantillons après libération des N-glycanes et marquage à l'aide de la plaque HILIC SPE 96 puits microélution Biozen N-Glycan
Cette note d'application compare deux solutions de nettoyage de glycanes pour fournir un kit commercial de digestion en solution et de marquage pour le profilage de glycanes d'un biosimilaire du trastuzumab et d'une glycoprotéine fortement sialylée (glycoprotéine acide alpha-1, AGP). Biozen N-Glycan Clean-Up est un produit d'extraction en phase solide HILIC dans une plaque de microélution 96 puits qui présente une excellente rétention et récupération des N-glycanes libérés et marqués.
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