Astuces techniques sur la préparation d’échantillon
Niveau : avancé
Préparation d’échantillon pour oligonucléotides
Bienvenue à notre astuce technique mensuelle ! Ce mois-ci, nous aborderons le sujet de la préparation des échantillons pour les oligonucléotides.
Les oligonucléotides sont des agents thérapeutiques très ciblés utilisés pour traiter une large gamme de maladies. Au cours de tout processus de développement de médicament, la pharmacocinétique du produit thérapeutique doit être évaluée, y compris pour les produits à base d’oligonucléotides. Cependant, contrairement aux petites molécules, les oligonucléotides présentent des défis uniques.
L'extraction d'oligonucléotides dans les matrices biologiques peut être considérée comme « une aiguille dans une botte de foin » selon le proverbe bien connu. Même les matrices biologiques relativement « faciles », comme le sérum, contiennent environ 70 mg/ml de protéines, approximativement 2 mg/ml de lipides sous forme de lipoprotéines, sans parler de la quantité importante de sels, d'acides organiques et de sucres présents. Si nous essayons d'isoler un oligonucléotide thérapeutique à des quantités de l'ordre du pico ou du microgramme/ml, ce n'est pas une tâche facile.
Les méthodes traditionnelles d'extraction des oligonucléotides utilisent un processus en deux étapes ; 1) les oligonucléotides sont extraits avec extraction liquide-liquide (LLE) dans la phase aqueuse 2) qui est ensuite isolée et purifiée avec un protocole SPE standard. L'ensemble de ce processus est long et difficile à automatiser. Clarity™ OTX élimine la nécessité d'une extraction liquide-liquide et réduit la formation d'émulsions ainsi que la perte d'échantillon, tout en fournissant une plateforme qui peut être automatisée. Clarity OTX offre une bonne solution prête à l'emploi pour l'extraction d'oligonucléotides à partir d'échantillons de plasma et de sérum. Le protocole générique est présenté à la Figure 1.
| Prétraitement d'échantillon | |||
|---|---|---|---|
| Fluides biologiques | Mélanger l'échantillon avec le tampon de lyse (1:1 ou 1:2) | ||
| Tissus | 1. Effectuer une digestion à la protéinase K ou homogénéisation du tissu 2. Mélanger l'échantillon avec le tampon de lyse (1:1 ou 1:2) |
||
| Protocole SPE | |||
| Solvant / Tampon | Volumes | ||
| Étapes | Plaque 96 puits | 100 mg | 2 mg |
| Conditionnement | Méthanol | 1 ml | 200 µl |
| Équilibrage | Acétate d'ammonium 50 mM, pH 5,5
*Pour les échantillons de tissus, ajouter 0,5 % de TX-100 et 0,1 % de cystéine au tampon mentionné ci-dessus |
1 ml | 200 µl |
| Charge | Échantillon prétraité | Jusqu'à 0,5 ml | 100 µl |
| Lavage | 50 mM Acétate d'ammonium, pH 5,5 / Acétonitrile (50:50) | 3 x 1 ml | 2-3 x 100 µl |
| Elution | 100 mM Bicarbonate d'ammonium, (pH 9,5) / Acétonitrile / Tétrahydrofurane (50:40:10) | 1ml | 2 x 75 µl |
Les échantillons de tissus constituent l'un des principaux défis à relever. Lorsque l'on travaille avec des échantillons de tissus, il est recommandé d'ajouter de la protéinase K, car il s'agit d'une protéase non spécifique qui peut améliorer l'activité enzymatique dans des conditions de dénaturation et de chaleur. Il est également recommandé d'ajouter des billes de céramique pendant cette étape pour aider à lyser le tissu. Avec les échantillons de tissus, une certaine optimisation des étapes de lavage et d'élution peut également être nécessaire.
Conseils pour l'optimisation de méthode :
Pour les solvants de lavage, il faut s’assurer d’utiliser un pH de 5,5, car il est essentiel pour la rétention de l'oligonucléotide sur le sorbant. Nous vous recommandons également d'explorer différents additifs organiques qui vous aideront à garantir l'élution de tous les contaminants hydrophobes au cours de cette étape de lavage. Les oligonucléotides sont liés par un mécanisme d'échange d'ions, ce qui vous permet, le cas échéant, d'utiliser des solvants de lavage plus puissants, tant que le pH est maintenu.
Dans le cas de l'étape d'élution, des récupérations améliorées peuvent être obtenues en augmentant le pH de la solution éluante et en ajustant le mélange d'additifs organiques utilisé, tout en maintenant une proportion de 50:50 de tampon par rapport au contenu organique. Les suggestions pour l'optimisation du tampon de lavage et d'élution sont résumées dans la Figure 2. Une astuce supplémentaire pour empêcher l'oxydation de PS en PO pendant l'étape d'élution consiste à ajouter du TCEP au tampon d'élution.
| Étape | Modification |
|---|---|
| Lavage | 50mM Acétate d'ammonium pH 5,5: Acétonitrile: MeOH (50:40:10 v/v/v) |
| 50mM Acétate d'ammonium pH 5,5: Acétonitrile (50:50 v/v) | |
| 50mM Acétate d'ammonium pH 5,5: Acétonitrile (30:70 v/v) | |
| 50mM Acétate d'ammonium pH 5,5: Acétonitrile: EtOAC (50:40:10 v/v/v) | |
| Élution | 100mM NH4HCO3 (pH 10): Acétonitrile: THF (50:40:10 v/v/v) |
| 100mM NH4HCO3 (pH 10): Acétonitrile: THF (50:25:25 v/v/v) |
Grâce à une optimisation appropriée de l'extraction des oligonucléotides à l’aide de Clarity OTX, il est possible de nettoyer efficacement les oligonucléotides thérapeutiques et leurs métabolites dans les échantillons biologiques. Cela élimine efficacement les débris cellulaires tels que les protéines, l'ADN génomique et les lipides qui peuvent masquer de manière significative les oligonucléotides thérapeutiques cibles. En éliminant ces contaminants, le bruit de fond du MS est considérablement réduit, ce qui facilite la bioanalyse quantitative.
Nous espérons que cette astuce vous a été utile ! Consultez notre guide ci-dessous et rendez-vous le mois prochain pour une nouvelle astuce technique !
Clarity OTX User's Guide for Extracting Oligo Therapeutics from Biological Samples
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