Overview: I moderni candidati ai farmaci ci pongono di fronte a nuove sfide cromatograficamente come la risoluzione di impurezze co-eluite. Una delle difficoltà più comuni che ci troviamo ad affrontare è la ritenzione di composti polari che non sono ritenuti nelle classiche consizioni di fase inversa..
La tradizionali colonne a fase inversa non forniscono un'adeguata ritenzione per la maggior parte dei composti polari analizzati in HPLC. I composti polari analizzati in fase inversa finiscono per eluire nel volume morto della colonna con conseguente distorsione della forma del picco e co-eluizione con altre specie polari non trattenute. L'eluizione a fattori di capacità bassi è una problematicanotevole per coloro che lavorano in LC-MS, in quanto le specie finiscono per eluire nella zona di soppressione ionica.
Questa nota tecnica illustrerà come l' HILIC sia un approccio alternativo, particolarmente efficace per LC-MS, alla fase inversa. L' HILIC utilizza alti livelli di solvente organico per eluire i composti polari, il che aiuta a migliorare la loro efficienza di ionizzazione durante l'analisi LC-MS.
Suggerimento: L' HILIC lavora ritenendo i composti polari in uno strato ricco d'acqua che si forma sulla superficie della particella di silice derivatizzate con gruppi polari (Fig. 1).
L'acetonitrile (MeCN) è il solvente debole durante l'HILIC, mentre il tampone di ammonio il solvente forte. I sali di ammonio sono fondamentali come controione in quanto facilitano la formazione del bi-strato, necessario alla separazione come mostrato nella Fig 1.
Una fase
stazionaria ricca di gruppi polari promuove la formazione di uno strato ricco
d'acqua sulla sua superficie della fase stazionaria con conseguente ritenzione
dei composti polari. Questi ultimi vengono eluiti man mano che la quantità di
acqua aumenta.
È importante equilibrare completamente la colonna HILIC prima dell'uso per assicurarsi che lo strato acquoso abbia avuto la quantità appropriata di tempo per formarsi. Se ciò non si verifica, verranno compromessi sia la ritenzione che la robustezza del tuo metodo.
Abbiamo menzionato l'uso di buffer di ammonio, ma ci sono molti altri fattori all'interno di un metodo HILIC che sono anche fondamentali per il suo successo.
Il primo è la selettività, la scelta della colonna corretta è la chiave. Come per le colonne in fase inversa, ci sono molte fasi stazionarie diverse per la cromatografia HILIC e ognuna offre diversi profili di selettività e vantaggi. E' sempre consigliabile provare 3 fasi stazionarie con meccanismi di interazioni complementari per identificare la migliore selettività per la tua applicazione.
I tipi di fasi stazionarie HILIC che potresti considerare includono:
- Silice non derivatizzata come Kinetex HILIC
- Fase diolica reticolata Luna HILIC
- Fasi NH2
- Fasi ioniche/zwitterioniche
Per quanto riguarda la fase mobile, è importante utilizzare il MeCN come solvente organico: solventi protici come il metanolo interferiscono con le interazioni tra analita e strato acquoso di cui abbiamo parlato. Anche la quantità di organico è importante. Una percentuale troppo elevata di organico all'inizio del gradiente prolunga l'equilibrio tra analita e strato acquoso legato; Il 90% di organico è ideale per le condizioni iniziali del metodo
Quando possibile, il profilo del gradiente dovrebbe essere 90% MeCN - 50% , ciò garantisce che lo strato acquoso legato alla silice sia completamente equilibrato all'inizio della corsa cromatografica. Se sono necessarie condizioni superiori al 50% di buffer per eluire il composto, è probabile che il metodo non sia più adatto all'HILIC, ma potrebbe essere migliore una C18 con gruppi polari incorporati come fase stazionaria. Sarà necessario ri-equilibrare lo strato acquoso legato; maggiore è la percentuale di buffer alla fine del gradiente, più lungo sarà il processo di ri-equilibrazione. Una ri-equilibrazione incompleta porterà a una scarsa riproducibilità e a una mancanza di robustezza del metodo.
Il parametro finale da considerare attentamente è il pH. Dovrebbero essere testati almeno 2 pH diversi. In genere si sugeriamo di testare il pH 3.2 (formiato di ammonio) e il pH 5.8 (acetato di ammonio). Diversi pH possono portare a selettività significativamente diverse (Fig. 2).
Grandi cambiamenti nell'ordine di eluizione tra chimica delle colonne e condizioni di fase mobile
L'HILIC è uno strumento estremamente utile per migliorare la ritenzione di composti polari. La tecnica può essere un approccio con cui ottenere metodi robusti. La scelta delle fasi mobili e degli altri parametri del metodo possono portare a separazioni di successo per composti impegnativi.