Wskazówki techniczne HPLC / UHPLC
Poziom: Podstawy
Optymalizacja każdego systemu LC do wydajności UHPLC
Na co zwrócić uwagę w metodzie HPLC
Poprawa sprawności rozdzielenia może być osiągnięta dzięki poniższym wskazówkom dotyczącym optymalizacji metody. Szczególnie w przypadku stosowania kolumn z wypełnieniem nie w pełni porowatym, te sugestie mogą znacznie polepszyć osiąganą sprawność w metodzie.
Podczas optymalizacji metod HPLC, nasze główne wysiłki powinny koncentrować się na minimalizacji dyspersji próbki w celu zmniejszenia poszerzania się pików i poprawy czułości oraz rozdzielczości. Główny nacisk powinien zostać położony na właściwym skoncentrowaniu próbki jako wąskiego pasma na początku kolumny podczas nastrzyku, a następnie minimalizowaniu dyspersji próbki na kolumnie.
Dostosowanie objętości nastrzyku i wybór odpowiedniego rozpuszczalnika próbki mogą znacznie pomóc w zmniejszeniu dyspersji próbki związanej z nastrzykiem. Dodatkowo, wprowadzenie prostego programowania dozownika do metody może zmniejszyć dyspersję wynikającej z niepożądanej objętości poza kolumną. Te sugestie znacznie poprawią kształt i sprawność metody, szczególnie dla szybkich rozdzieleń LC przy użyciu wypełnień typu core-shell.
Problem: Wszystkie piki są szerokie
1. Sprawdź objętość próbki: Błędy w podawaniu próbki mogą zniweczyć wzrost wydajności osiągany dzięki stosowaniu cząsteczek typu core-shell. Jeżeli próbka jest nastrzykiwana w tym samym składzie dodatku organicznego, co faza ruchoma i w warunkach izokratycznych, początkowa szerokość pasma na kolumnie będzie wprost proporcjonalna do objętości nastrzyku. W związku z tym, próbka o dużej objętości jest podawana jako szerokie pasmo na kolumnie i daje niską sprawność piku.
Rozwiązanie: Aby zmniejszyć straty sprawności związane z nastrzykami o dużej objętości, możliwe jest wstępne skoncentrowanie próbki na głowicy kolumny poprzez zastosowanie rozpuszczalnika słabszego niż faza ruchoma. Można również zmniejszyć objętość podawanej próbki. W przypadku stosowania kolumn o wysokiej sprawności często potrzebne są mniejsze ilości próbki w celu uzyskania dobrego sygnału odpowiedzi.
2. Sprawdź rozpuszczalnik do próbek: Jeżeli moc rozpuszczalnika organicznego jest większa niż fazy ruchomej HPLC, wówczas próbka zostanie podana jako rozproszone pasmo na szczycie kolumny HPLC. Może to wystąpić zarówno w metodach izokratycznych, jak i gradientowych i może zniweczyć wiele korzyści związanych z wydajnością, jakie zapewnia kolumna.
• Metody gradientowe, w których próbka jest podawana w rozpuszczalniku mocniejszym niż faza ruchoma, związek wykazuje efekt "uślizgu", co powoduje poszerzenie i rozdzielenie pików.
• Metody izokratyczne, w których rozpuszczalnik jest silniejszy niż faza ruchoma, spowodują nadmierne rozproszenie próbki.
Rozwiązanie: Wstrzyknij słaby rozpuszczalnik. Najlepiej jest użyć rozpuszczalnika o mocy słabszej lub równej mocy organicznej fazy ruchomej, tak aby próbka skupiała się na czole kolumny, dając ostrzejsze piki (tj. wyższą sprawność).
Cel: Dalsze skrócenie czasu analizy i objętości pików w metodach gradientowych
1. Sprawdź program nastrzyków: Objętość pozakolumnowa przed kolumną spowoduje rozproszenie próbki w drodze do kolumny; pętla iniektora jest głównym źródłem dodatkowej objętości pozakolumnowej.
Rozwiązanie: Możliwe jest ominięcie pętli za pomocą programu nastrzyków w metodzie (po opuszczeniu przez próbkę pętli nastrzykowej). Tabela 1 i rysunek 1 przedstawiają przykład, w którym pętla nastrzykowa jest omijana po nastrzyku w celu zmniejszenia objętości opóźnienia systemu.
| Etapy | Polecenia | Komentarze | |
|---|---|---|---|
| 1 | POBIERZ | Pobierz objętość próbki (objętość nastrzyku) z fiolki. | |
| 2 | NASTRZYK | Wprowadzenie próbki do linii przepływu. | |
| 3 | POCZEKAJ | Przepłukać pętlę do pobierania próbek po nastrzyku (czas oczekiwania = 6x (objętość iniekcji + 5 μL) / natężenie przepływu). | |
| 4 | ZAWÓR obejścia | Bezpośredni przepływ z pompy do kolumny, z pominięciem zaworu nastrzykowego w celu wykluczenia objętości opóźnienia~200 – 500 μL ze ścieżki automatycznego nastrzyku. | |
| 5 | POCZEKAJ 1,5 min | Czas pracy zaworu obejścia (Czas oczekiwania = Czas pracy - 1 min). | |
| 6 | ZAWÓR główny | Zawór przełączający z pozycji obejścia na pozycję nastrzyku. |
Tabela 1
* Mainpass peak is an injector artifact due to switching the injector valve back to include the injector loop in the flow (to flush injector in preparation for the next injection).
Rys. 1
Webinar: Optymalizacja systemu HPLC
Przewodnik po selektywnoścach HPLC/UHPLC w fazie odwróconej
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
CONNECT WITH US
