Suggerimento tecnico HPLC/UHPLC
Livello: Base
Ottimizzazione del Sistema HPLC per ottenere prestazioni UHPLC
L'importanza del metodo HPLC
I seguenti suggerimenti di ottimizzazione relativi al metodo vi consentiranno di migliorare le prestazioni separative delle colonne LC. In particolare, usando colonne HPLC Core-Shell, questi suggerimenti ne incrementeranno notevolmente le performance.
Quando si ottimizzano i metodi HPLC, i nostri sforzi principali dovrebbero concentrarsi sull'assicurare la minimizzazione della dispersione del campione per mitigare l'allargamento di banda e migliorare la sensibilità e la risoluzione dei picchi. Ciò determina la corretta focalizzazione del campione in una banda stretta in testa alla colonna, minimizzandone la dispersione.
Regolare i volumi di iniezione e selezionare un diluente del campione appropriato può aiutare notevolmente a ridurre la dispersione del campione legata all'iniezione. Inoltre, integrare una semplice programmazione dell'iniettore nel metodo può ridurre la dispersione dovuta al volume extra-colonna indesiderato. Questi suggerimenti miglioreranno notevolmente la forma e l'efficienza dei picchi, soprattutto per le separazioni condotte con colonne core-shell.
Problema: tutti i picchi sono larghi
1. Controlla il volume del campione: gli errori nell’iniezione del campione possono impedire alla colonna Core-Shell di raggiungere performance ultra-elevate tipiche di questo materiale. In isocratica, se si inietta il campione alla stessa concentrazione di organico della fase mobile, la larghezza di banda iniziale sarà proporzionale al volume di iniezione. Di conseguenza, un alto volume di iniezione genererà picchi larghi (bassa efficienza).
Soluzione: pre-concentra il tuo campione. Per ridurre la perdita di efficienza dovuta a grandi volumi di iniezione, puoi pre-concentrare il tuo campione in testa alla colonna usando solvente a più bassa concentrazione rispetto alla fase mobile.
2. Controlla il solvente di iniezione: se il sovente di iniezione ha un potere eluente più forte della fase mobile, il campione diffonderà in testa alla colonna generando un allargamento della banda cromatografica. Questo effetto si verifica sia per metodi in gradiente sia per metodi in isocratica, e impedisce il raggiungimento delle massime prestazioni della colonna.
• Per applicazioni in gradiente in cui il campione è iniettato con forza eluente maggiore della fase mobile, si avrà bassa efficienza e possibile sdoppiamento dei picchi.
• Per i metodi in isocratica, la maggiore forza eluente del campione causerà bassa efficienza.
Soluzione: Inietta in un solvente più debole. E’ sempre meglio iniettare il campione in un solvente dal potere eluente più basso rispetto alla fase mobile : così facendo il campione focalizzerà in testa alla colonna e si otterranno picchi più stretti (maggiore efficienza).
Obiettivo: Applicare gradienti ripidi UHPLC per ottenere la massima velocità e picchi più stretti
1. Controllare le impostazioni dell’iniettore: Il volume extra-colonna causa la dispersione del campione nel percorso dall’iniettore verso la colonna; il loop presente nell'iniettore è una delle principali fonti di allargamento di banda.
Soluzione: È possibile bypassare la fluidica dell’autocampionatore attraverso l’esecuzione di uno specifico programma di iniezione (dopo che il campione ha lasciato il loop dell'iniettore). La Tabella 1 e la Figura 1 mostrano un esempio in cui il loop di iniezione viene “bypassato” dopo l'iniezione per ridurre il “dwell volume” del sistema.
| Steps | Commands | Comments | |
|---|---|---|---|
| 1 | DRAW | Prelevare il volume del campione (volume di iniezione) dalla vial. | |
| 2 | INJECT | Introdurre il campione nel “flow path”. | |
| 3 | WAIT | Lavare il loop del campione dopo l'iniezione (tempo = 6x (volume di iniezione + 5 μL) / velocità di flusso). | |
| 4 | VALVE bypass | Bypassare la valvola di iniezione e portare il flusso dalla pompa alla colonna per contenere il “Dwell Volume” (~200 – 500 μL dal percorso dell'auto-iniettore). | |
| 5 | WAIT 1.5 min | Il periodo di tempo di bypass della valvola (tempo di attesa = tempo di esecuzione - 1 min). | |
| 6 | VALVE mainpass | Spostare la valvola dalla posizione di bypass a quella di iniezione. |
Tabella 1
* Mainpass peak is an injector artifact due to switching the injector valve back to include the injector loop in the flow (to flush injector in preparation for the next injection).
Figura 1
Webinar sull'ottimizzazione
del sistema HPLC
Guida per Selettività in Fase Inversa in HPLC/UHPLC
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
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