Astuce technique HPLC/UHPLC
Niveau : débutant
Analytes basiques et avantages des supports de silice modifiés pour la chromatographie liquide en phase inverse
Les phases stationnaires à base de silice sont actuellement les phases les plus fréquemment utilisées en chromatographie liquide. Cependant, les colonnes traditionnelles C18 peuvent parfois donner une mauvaise forme de pic (traînée de pic) pour les analytes basiques analysés à pH acide ; leur stabilité peut également être limitée en raison de l'hydrolyse progressive des silanes à pH élevé. Grâce aux technologies de réticulation et d'end-capping, les interactions secondaires indésirables de la silice et sa stabilité limitée à haut pH notamment ont été significativement améliorées.
Les développements les plus récents sur le sujet de l'analyse des analytes basiques à pH acide est l’introduction de colonnes C18 avec une charge positive résiduelle sur le support de silice. Cela permet aux colonnes d’être stables en conditions 100% aqueuses, améliorant ainsi la rétention des composés basiques. Cela minimise également les interactions secondaires (ioniques) entre les bases chargées positivement et les groupements silanols résiduels en raison de la répulsion des charges à la surface de la silice. Les composés basiques sont ainsi mieux retenus et élués avec une bonne forme de pic en conditions acides, conditions qui sont généralement préférées. La figure 1 montre un exemple d'amélioration de la forme de pic de la chlorphéniramine, un antihistaminique basique, à l'aide d'une colonne Kinetex™ PS C18 column dotée de cette technologie.
Figure 1. Amélioration de la rétention en phase inverse et de la forme de pic à l'aide de la colonne Kinetex PS C18.
Cependant, lorsque des pH extrêmes sont nécessaires pour l’analyse, de nouveaux matériaux hybrides ont été conçus et permettent d’étendre considérablement le domaine de stabilité aux pH élevés des phases des colonnes HPLC. Grâce à ce type de technologie, il est possible de travailler à pH élevé pour déprotoner les composés basiques, augmentant ainsi leur hydrophobicité (et donc leur rétention) tout en éliminant la possibilité d'échange d'ions. Cette approche est particulièrement utile lorsqu'on considère les composés basiques polaires, car la combinaison d'une bonne forme de pic avec une rétention améliorée est parfois nécessaire, en particulier en LC-MS/MS où l'élution dans un pourcentage de solvant organique plus élevé peut favoriser un meilleur signal. Des colonnes telles que la colonne Gemini™-NX et Kinetex EVO peuvent être utilisées sur une gamme de pH 1-12. La figure 2 montre l'analyse réussie de composés basiques à pH 8,2 en utilisant une colonne Kinetex EVO C18 avec cette technologie.
Composés basiques analysés en LC/MS avec une phase mobile à pH basique
L'efficacité de l'utilisation de phases mobiles à pH basique est étudiée pour la quantification de composés basiques en ESI+ LC/MS/MS en comparant les limites de détection (LOD), les limites de quantification (LOQ), les gammes de linéarité, la précision et l'exactitude observées dans des phases mobiles à pH acide ou basique.
Utilisation des technique de « pH-LC » pour contrôler la sélectivité des composés acides et basiques en HPLC
L'efficacité de l'utilisation des techniques de « pH-LC » est étudiée pour l’analyse d'un mélange de composés acides (naproxène), basiques (amitriptyline) et neutres (toluène) à l'aide d'une colonne Gemini 5 µm NX-C18.
Marques commerciales
Gemini et Kinetex appartiennent à Phenomenex.
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
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