Astuce technique HPLC/UHPLC
Niveau : Débutant
Optimisation du système LC pour obtenir des performances UHPLC quel que soit le système HPLC
L'importance de la méthode HPLC
Les améliorations techniques proposées ci-dessous permettent d’optimiser les performances pour toutes vos séparations. En particulier lors de l'utilisation de colonnes core-shell, les suggestions suivantes vous permettent d’améliorer considérablement les performances de votre méthode.
Lors de l'optimisation des méthodes HPLC, les principaux efforts doivent se concentrer sur la minimisation de la dispersion de l'échantillon afin de réduire l'élargissement des pics et d'améliorer la sensibilité et la résolution de vos pics. Cela implique de bien focaliser l'échantillon en une bande étroite en tête de la colonne lors de l'injection, puis de travailler à minimiser la dispersion de l'échantillon à travers la colonne.
Le réglage des volumes d'injection et la sélection d'un diluant d'échantillon approprié peuvent grandement contribuer à réduire la dispersion de l'échantillon liée à l'injection. De plus, l'ajout dans la méthode d'une simple programmation de l’injecteur peut minimiser le volume extra colonne. Ces suggestions amélioreront considérablement la forme et l'efficacité des pics, en particulier pour les séparations LC rapides de type core-shell.
Problème : tous les pics sont larges
1. Vérifier le volume de l'échantillon : Des erreurs dans le chargement de l'échantillon peuvent annuler le gain de performance fourni par la particule core-shell. Si l'échantillon est injecté dans un solvant de composition identique à la phase mobile en mode isocratique, la bande d’élution initiale sur la colonne sera directement proportionnelle au volume d'injection. Pour cette raison, un grand volume d’échantillon injecté va correspondre à une large bande d’élution sur la colonne (faible efficacité).
Solution : Pour réduire la perte d'efficacité des injections larges volumes, il est possible de pré-concentrer l’échantillon en tête de colonne en utilisant un solvant de dilution plus faible que la phase mobile. Vous pouvez également réduire le volume d'injection de votre échantillon. Lorsque des colonnes à haute efficacité sont utilisées, des quantités d'échantillons plus faibles sont souvent nécessaires pour obtenir une bonne réponse du signal.
2. Vérifier le diluant de l’échantillon : Si la force organique du diluant est supérieure à celle de la phase mobile HPLC, la bande d’élution de l'échantillon va se diffuser en tête de la colonne HPLC. Cela peut se produire aussi bien avec les méthodes isocratiques que gradient et annuler une grande partie des gains de performance fournis par la colonne.
• Les méthodes utilisant un gradient où l'échantillon est injecté dans des diluants plus forts que la phase mobile peuvent entraîner un élargissement et une division des pics.
• Les méthodes isocratiques où le diluant est plus fort que la phase mobile entraîneront une dispersion excessive de l'échantillon.
Solution : Injecter dans un solvant faible. Il est préférable d'utiliser un diluant plus faible ou ayant la même force organique de la phase mobile afin que l'échantillon se concentre en tête de colonne, ce qui améliore la finesse des pics (c'est-à-dire, augmente l’efficacité).
Objectif : Meilleures capacités de pics et temps d’analyse réduit pour les séparations en mode gradient
1. Vérifier la programmation de l'injecteur : Le volume extra-colonne en tête de la colonne provoquera la dispersion de l'échantillon dans la colonne. La boucle d'injection est une des principales sources de volume extra-colonne.
Solution : Il est possible de contourner la boucle en programmant l'injecteur pendant la méthode d'analyse (après que l'échantillon ait quitté la boucle de l'injecteur). Le tableau 1 et la figure 1 montrent un exemple où la boucle d'injection est contournée après l'injection pour réduire le volume de délai du système.
| Étapes | Commandes | Commentaires | |
|---|---|---|---|
| 1 | DRAW | Définir le volume de l'échantillon (volume d'injection) contenu dans le flacon. | |
| 2 | INJECT | Injecter l'échantillon. | |
| 3 | WAIT | Rincer la boucle de l'échantillon après l'injection (temps d'attente = 6x (volume d'injection + 5 μl) / débit). | |
| 4 | VALVE bypass | Diriger le flux de la pompe vers la colonne en contournant la vanne d'injection pour s’affranchir du volume de délai (~ 200 - 500 μl de la trajectoire de l'auto-injecteur). | |
| 5 | WAIT 1.5 min | Temps nécessaire au contournement de la boucle (Temps d'attente = Durée du run moins 1 min). | |
| 6 | VALVE mainpass | Changer la position de la valve de bypass à la position d'injection. |
Tableau 1
* Mainpass peak is an injector artifact due to switching the injector valve back to include the injector loop in the flow (to flush injector in preparation for the next injection).
Figure 1
HPLC System Optimisation
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The Ultimate Guide to HPLC/UHPLC Reversed Phase Selectivity
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