HPLC/UHPLC Technischer Tipp
Niveau: Grundlagen
LC-System-Optimierung für UHPLC-Leistung auf jeder HPLC
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Die HPLC-Methode - warum sie wichtig ist
Mit den folgenden methodenbezogenen Optimierungstipps kann die Leistung aller Säulentrennungen verbessert werden. Insbesondere bei der Verwendung von Core-Shell-Säulen können diese Vorschläge die Leistung Ihrer Methode erheblich steigern.
Bei der Optimierung von HPLC-Methoden sollten sich unsere Bemühungen vor allem auf die Minimierung der Probendispersion konzentrieren, um die Bandenverbreiterung zu verringern und die Empfindlichkeit und Auflösung Ihrer Peaks zu verbessern. Dies bedeutet, dass die Probe bei der Injektion als dichtes Band am Kopf der Säule aufkonzentriert werden muss und dass die Probendispersion durch die Säule minimiert werden muss.
Die Anpassung des Injektionsvolumens und die Auswahl eines geeigneten Probenverdünnungsmittels können erheblich zur Verringerung der injektionsbedingten Probendispersion beitragen. Darüber hinaus kann die Aufnahme eines einfachen Injektorprogramms in die Methode die Dispersion aufgrund von unerwünschtem Extra-Säulenvolumen verringern. Mit diesen Tipps lassen sich Peakform und Effizienz erheblich verbessern, insbesondere bei schnellen Core-Shell-LC-Trennungen.
Das Problem: Alle Peaks sind breit
1. Überprüfen Sie das Probenvolumen: Fehler bei der Injektion der Probe können den Leistungsgewinn, den die Core-Shell-Partikel erzielen, zunichte machen. Wenn Sie unter isokratischen Bedingungen die Probe in dem gleichen Lösungsmittel wie die mobile Phase injizieren, ist die anfängliche Peakbreite auf der Säule direkt proportional zum Injektionsvolumen. Daher wird ein großes Probenvolumen als breites Band auf die Säule injiziert und führt zu einer geringeren Effizienz des Peak.
Lösung: Um den Effizienzverlust bei großvolumigen Injektionen zu reduzieren, ist es möglich, die Probe am Kopf der Säule aufzukonzentrieren, indem ein schwächeres Injektionslösungsmittel als die mobile Phase verwendet wird. Sie können auch das Injektionsvolumen der Probe reduzieren. Wenn Säulen mit hoher Effizienz verwendet werden, sind oft geringere Probenmengen erforderlich, um eine gute Signalintensität zu erhalten.
2. Prüfen Sie das Probenlösungsmittel: Wenn die Stärke und der Organikanteil des Injektionslösungsmittels größer ist als die der mobilen Phase, dann wird die Probe als diffuse Bande auf den Kopf der HPLC-Säule geladen. Dies kann sowohl bei isokratischen als auch bei Gradientenmethoden auftreten und kann einen Großteil der Leistungsvorteile der Säule zunichte machen.
• Bei Gradientenmethoden, bei denen die Probe in einem stärkeren Injektionslösungsmittel als die mobile Phase injiziert wird, zeigt die Verbindung Surfing-Effekte, was zu einer Verbreiterung und Aufspaltung der Peaks führt
• Isokratische Methoden, bei denen das Injektionslösungsmittel stärker ist als die mobile Phase, führen zu einer übermäßigen Probendispersion.
Lösung: Injizieren Sie in einem schwachen Lösungsmittel. Es ist am besten, ein Probenlösungsmittel zu verwenden, das entweder schwächer oder gleich stark wie die Stärke der mobilen Phase ist, damit die Probe auf dem Säulenkopf fokussiert wird, was zu schärferen Peaks führt (d. h. zu einer höheren Effizienz).
Ziel: Weitere Verkürzung der Laufzeit und Erhöhung der Peakkapazität bei Gradientenmethoden
1. Injektorprogramm prüfen: Extra-Säulenvolumen vor der Säule verursacht eine Dispersion der Probe auf dem Weg zur Säule; die Injektorschleife ist eine Hauptquelle für Extra-Säulenvolumen
Lösung: Es ist möglich, die Schleife mit einem Injektorprogramm während der Analysemethode zu umgehen (nachdem die Probe die Injektorschleife verlassen hat). Tabelle 1 und Abbildung 1 zeigen ein Beispiel, bei dem die Injektionsschleife nach der Injektion umgangen wird, um das Systemverweilvolumen zu reduzieren.
| Schritte | Befehle | Bemerkungen |
|---|---|---|
| 1 | AUFZIEHEN | Volumen der Probe (Injektionsvolumen) aus dem Fläschchen entnehmen |
| 2 | INJINZIEREN | Probe in den Fließweg überführen |
| 3 | WARTEN | Probenschleife nach der Injektion spülen (Wartezeit = 6x (Injektionsvolumen + 5 μL) / Flussrate) |
| 4 | VENTIL-Bypass | Direkter Fluss von der Pumpe zur Säule unter Umgehung des Injektionsventils, um das Verzögerungsvolumen zu reduzieren (~200 - 500 μL des Totvolumens des Autosamplers) |
| 5 | WARTEN 1,5 min. | Länge der VENTIL-Bypass-Zeit (Wartezeit = Laufzeit - 1 min) |
| 6 | VENTIL-Mainpass | Ventil von Bypass auf Einspritzposition schalten |
Tabelle 1
* Der Mainpass-Peak ist ein Injektorartefakt, das durch das Zurückschalten des Injektionsventils entsteht, um die Injektorschleife wieder in den Fluss einzubeziehen (um den Injektor zur Vorbereitung der nächsten Injektion zu spülen).
Abbildung 1
HPLC System Optimisation
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