Mejorando el rendimiento de las columnas de Micro LC

Las columnas de micro LC ofrecen a los cromatografistas la oportunidad de mejorar la sensibilidad o de utilizar flujos más bajos debido a su menor diámetro interno. La desventaja en la reducción del diámetro de la columna es que, para maximizar la eficacia, es necesario reducir al mínimo las fuentes de ensanchamiento de la banda y la preparación de las muestras es fundamental para mejorar la vida útil de la columna.

Sample Preparation

El uso de un formato de trampa y elución proporcionará muestras más limpias para inyectarlas en la columna analítica y mejorará la vida útil de la columna.
Utilizando técnicas de preparación de muestras, como la extracción en fase sólida (productos Strata-X^® SPE) o los accesorios (Phenex™ Syringe Filters) se reduce al mínimo la inyección de contaminantes no deseados en el sistema y se puede prolongar también la vida útil de la misma.

Configuración de la trampa

PLa selectividad de la fase y la dirección del flujo de fase móvil hacia y desde la columna trampa, contribuirán a la eficacia y vida útil de la columna. La elección de una fase estacionaria apropiada para su trampa ayudará a mejorar la separación, mientras que la dirección del flujo durante el método la trampa y el de elución puede mejorar la vida útil de la columna al reducir al mínimo la acumulación de partículas cuando se utiliza en la dirección de avance.

Modo forward elute- elución en la misma dirección

En la dirección de avance, su inyección carga la muestra en la trampa en la dirección de avance. Mientras que se arrastran los residuos, puede realizar aquí un paso de lavado si lo desea. Una vez que se cambia la válvula de la trampa, la muestra se bombea desde la columna de la trampa a la columna analítica. Con la elución hacia adelante la muestra tiene que pasar por la columna trampa para llegar a la columna analítica y la fase estacionaria en esta columna trampa tiene más impacto en la separación que en el modo de elución inversa. También significa que cualquier materia insoluble permanece atrapado en esta columna y su columna de Micro LC column está mucho mejor protegida.

cut away of lc system pump for forward elute

Flujo inverso

Con la elución inversa la muestra se carga y se lava de la misma manera, pero ahora cuando cambiamos la válvula el gradiente se bombea en la dirección inversa, eluyendo la muestra de nuevo de la trampa en la misma dirección en que se cargó en ella. Esto hace que el material de empaque sea menos importante en términos de selectividad general, ya que el camino del flujo es más corto, pero también significa que la materia insoluble tiene el potencial de ser expulsada de la trampa y llevada a su columna Micro LC. En la dirección inversa también puede beneficiarse de usar una trampa de identificación más amplia; que puede ser cargada a un flujo más rápid, acelerando este paso si tiene una aplicación sensible al tiempo.

cut away of lc system pump for reverse flow

Flujos típicos

Para las columnas de 1 mm de diámetro interior, el flujo típico es de 1-75 µL/min

Carga

Carga de muestra típica 1-10 µg

¿Qué es lo que hay en un Nombre? - Descifre el Código de Dibenzodioxinas y Dibenzofuranos

Las dioxinas y los furanos son compuestos tóxicos que persisten en el medio ambiente, pero ¿cómo se originan y cómo monitoreamos la variedad de análogos asociados con estos compuestos? En el contexto de las pruebas ambientales, "dioxinas" y "furanos" se refieren específicamente a dibenzodioxinas policloradas (compuestos PCDD) y dibenzofuranos policlorados (compuestos PCDF). Estos compuestos son contaminantes orgánicos persistentes (compuestos POP) que tienen afinidad por una proteína de factor de transcripción llamada Receptor de aril-hidrocarburo. No estamos hablando de los compuestos dioxano, dioxina, furano o tetrahidrofurano (THF) durante una ronda típica de pruebas de "dioxina y furano", simplemente para disipar cualquier malentendido. Las discusiones sobre los COP entre los químicos ambientales pueden parecer un club secreto para los recién llegados, dada la variedad de conocimientos previos asumidos y la conciencia del “código secreto” por el que se refieren a estos compuestos. Presentaré la importancia de las pruebas de “dioxinas y furanos” al abordar el origen y la nomenclatura de los COP de dioxinas y furanos.

Los contaminantes PCDD "dioxinas" tienen antecedentes históricos y se conocen históricamente como biproductos de la producción de herbicidas como el 2,4,5-T (ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético) y el 2,4-D (2,4 -Ácido diclorofenoxiacético), que juntos componen el Agente Naranja. Estos herbicidas en sí tienen un perfil de toxicidad, pero los biproductos des dioxinas son mucho más tóxicos. Los biproductos de dioxinas inicialmente no fueron monitoreados durante la producción o uso de estos herbicidas debido a una falta histórica de conciencia sobre la intensa toxicidad de las dibenzodioxinas policloradas. Históricamente, el uso a gran escala relevante y los accidentes industriales que involucran a estos herbicidas han dado como resultado una contaminación ambiental persistente con dioxinas.

Un intermedio crítico durante la síntesis de herbicidas de fenilo policlorado es un fenolato policlorado, que es propenso a reacciones secundarias que producen compuestos de PCDD. Los propios fenoles policlorados son pesticidas que pueden generar PCDD. Hoy en día, tanto los PCDD como los PCDF también se controlan como biproductos de la combustión incompleta de la basura, ya sea en el hogar o en grandes cantidades de basura destinadas a los vertederos. El análisis isotópico puede utilizarse para correlacionar los resultados analíticos de las dioxinas con la fuente o el lugar en el que se originaron los PCDD o PCDF. Los contaminantes “furanos” de PCDF pueden resultar de una variedad de reacciones oxidativas hacia compuestos de bifenilos policlorados (PCB). Los compuestos PCBs en sí mismos son tóxicos y son compuestos dieléctricos comunes que se utilizan dentro de los condensadores eléctricos, lo que lleva a su omnipresencia en los vertederos.

¡Estoy tratando de separar mi 1238 de mi 2378!"
Podemos entender esto numerando primero las posiciones alrededor de nuestros compuestos dibenzo a los que se pueden unir los cloro. Observe que los carbonos terciarios no están numerados. Tenga cuidado cuando se habla de dibenzodioxinas policloradas (PCDD) y dibenzodioxinas policloradas (PCDF). La siguiente consideración es el prefijo que denota el número de cloros que están unidos al compuesto dibenzo. Los métodos ambientales generalmente se refieren a compuestos de PCDD y PCDF con cuatro o más sustituyentes de cloro, cuyos prefijos y abreviaturas se muestran en la Tabla 1. Los análogos "octaclorados" no requieren numeración, ya que todas las posiciones de los sustituyentes están enlazadas con un sustituyente de cloro.

Tabla 1 - Ejemplos de PCDD y PCDF
# de sustituyentes Cl	Ejemplos
(4) Tetra – T	Ejemplo: dioxin (PCDD) Nombre: 2,3,7,8-TCDD
(5) Penta – Pe	Ejemplo: dioxin (PCDD) Nombre: 1,2,3,7,8-PeCDD
(6) Hexa – Hx	Ejemplo: furan (PCDF) Nombre: 1,2,3,4,6,8-HxCDF
(7) Hepta – Hp	Ejemplo: dioxin (PCDD) Nombre: 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD
(8) Octa – O	Ejemplo: furan (PCDF) Nombre: OCDF

Los compuestos de PCDD y PCDF a menudo se denominan mediante la nomenclatura que se muestra en la Tabla 1. Hay ocasiones durante las pruebas de rutina en las que se hace referencia a estos compuestos simplemente por la posición de los sustituyentes de cloro, como el"separar un 1238 de un 2378". Aclare que el contexto se refiere específicamente a compuestos de PCDD o compuestos de PCDF, especialmente cuando se habla con miembros de otros laboratorios u organizaciones.

Gracias a los químicos analíticos y técnicos de laboratorio que monitorean las muestras ambientales en busca de compuestos de PCDD y PCDF, junto con los compuestos de herbicidas y PCB relacionados. Es de esperar que hayamos disipado la ambigüedad que puede rodear el análisis de "dioxinas y furanos" para cualquier recién llegado al tema.

Heaton, A.: 1996, ‘Pesticides’, in: Heaton, A. (ed.), The Chemical Industry, Blackie Academic & Professional, London, pp. 238-43.

Crosby DG, Moilanen KW, Wong AS. Environmental Generation and Degradation of Dibenzodioxins and Dibenzofurans. Environ Health Perspect. 1973;5:259-266. doi:10.1289/ehp.7305259

¿Por qué mis recuperaciones son superiores al 100%?

Cuando se realiza una extracción de analitos con SPE esperamos una recuperación del 100%. Si la recuperación es menor, esto sugeriría que hay un problema con la recuperación del analito del sorbente, pero ¿cuáles son algunas de las razones por las que puede ver una recuperación mayor de la que esperaba (o más del 100%)?

Problemas comunes

Interferencias de co-elución
Contaminantes del disolvente o de los sorbentes seleccionados
El estándar interno es problemático haciendo que su punto de referencia sea inexacto
Los cálculos de recuperación son inexactos

Interferencias de co-elución: Estas están típicamente presentes en la matriz y el objetivo del paso SPE es eliminarlas. Si se experimentan recuperaciones superiores al 100% el primer paso sería comprobar el eluyente mediante una técnica analítica ortogonal para identificar que el aumento de la recuperación es resultado de una co-elución. Cuando se identifica una co-elución hay algunas soluciones posibles.

Modificar los pasos de lavado del método SPE para eliminar selectivamente la impureza durante el lavado.
Seleccionar un sorbente SPE alternativo que eliminará mejor estas impurezas. Esto es más fácil si el analito / impureza puede ser ionizado selectivamente, ya que un sorbente de intercambio de iones proporcionará muy a menudo extractos más limpios que los de fase reversa o normal.
Ajuste su método analítico para resolver los 2 picos analíticamente negando la necesidad de eliminar esta impureza durante el paso de SPE.
Haga pasar una muestra de plasma de blanco, esto le permitirá determinar las impurezas presentes y usar este blanco en los cálculos para restar de su recuperación.

Contaminantes del disolvente o del sorbente: TEstas serán típicamente impurezas presentes en los materiales de partida que son similares en naturaleza a su compuesto de interés y como resultado co-eluirán con él durante la SPE y el análisis analítico subsiguiente. Puede seguir los pasos anteriores para eliminar las impurezas coeluyentes o, alternativamente, como no se trata de una impureza presente en su matriz, puede identificar el nivel presente en el sorbente utilizando ensayos del blanco y restarlo de su pico principal durante el cálculo. Antes de agregar su muestra si usted equilibra su sorbente con el disolvente de elución esto debería eliminar los contaminantes potenciales del sorbente antes de agregar la muestra. Para las impurezas introducidas desde el disolvente, típicamente cambiando el disolvente debería resolver esto.

El estándar interno es problemático: Si su estándar interno no muestra una recuperación del 100%, sus cálculos posteriores serán inexactos. Siempre es una buena práctica usar un estándar interno similar en naturaleza al compuesto de su interés, ya que esto dará el punto de referencia más consistente para su método. Si existe la preocupación de que su patrón interno no muestre una buena recuperación del material SPE utilizando su método, puede utilizar un patrón externo que se añade al disolvente de elución para calcular la recuperación absoluta.

Los cálculos de recuperación son inexactos: Es importante seguir este paso sabiamente para determinar dónde están apareciendo los errores.

Errores de cálculo: compruebe todos los cálculos y tenga en cuenta todos los factores de dilución.
Errores de Integración- Reintegrar todos los picos y usar los cálculos manuales para confirmar.
Errores del método analítico - Asegurar que el método analítico utilizado permite una correcta integración y cálculo. Asegurarse de que no se utilizan disolventes fuertes para la inyección y realizar una calibración a través de un número de diluciones para asegurar la linealidad. Solucione los errores del método analítico para determinar los factores que pueden conducir a una mala reproducibilidad.
Asegúrese de que las detecciones seleccionadas sean apropiadas y funcionen correctamente.