Améliorer les performances des colonnes Micro LC

Les colonnes micro LC vous permettent d'améliorer la sensibilité ou d'utiliser des débits plus faibles en raison de leur diamètre interne plus petit. Toutefois, dans le but de maximiser l'efficacité, les sources d'élargissement de bande doivent être réduite et une préparation d'échantillon adaptée est essentielle pour améliorer la durée de vie de la colonne. Deux paramètres pouvant être les inconvenients de l'utilisation de colonne à diametre interne réduit.

Préparation d'échantillon

L'utilisation d'un format "Trap and Elute" permet d'obtenir des échantillons plus propres avant de les injecter sur la colonne d'analyse et ainsi prolonger la durée de vie de la colonne.
L'utilisation de techniques de préparation d'échantillon, telles que l'extraction en phase solide (produits Strata-X^® SPE) ou d'accessoires (Filtres seringues Phenex™) pour minimiser l'injection de contaminants dans votre système peut également prolonger la durée de vie de la colonne.

Configuration des pièges

La sélectivité de la phase et la direction du débit de la phase mobile vers et hors de la colonne de piégeage contribueront à l'efficacité et à la durée de vie de la colonne. Le choix d'une phase stationnaire appropriée pour votre piège contribuera à améliorer la séparation, tandis que la direction du débit vers l'avant pendant votre méthode de piégeage et d'élution peut prolonger la durée de vie de la colonne en minimisant l'accumulation de particules

Elution vers l'avant

En cas d'élution vers l'avant, l'échantillon est retenu sur le piège, les molécules avec peu d'affinitées seront evacuées vers la poubelle (waste). Une fois le chargement passé, vous pouvez effectuer une étape de lavage si vous le souhaitez. Une fois que vous avez modifié la valve du piège, l'échantillon est élué de la colonne piégée vers la colonne analytique. En cas d'élution vers l'avant, l'échantillon doit passer à travers la colonne piégée pour atteindre la colonne analytique ; la phase stationnaire dans cette colonne piégée a plus d'impact sur la séparation que dans le mode d'élution inverse. Cela signifie également que toute matière insoluble reste piégée dans cette colonne et que votre colonne Micro LC est bien mieux protégée.

cut away of lc system pump for forward elute

Inversion du débit

En cas d'élution inverse, l'échantillon est chargé et lavé de la même manière, mais maintenant, lorsque vous changez la valve, le gradient est pompé dans le sens inverse, ce qui permet d'éluer l'échantillon hors du piège dans la même direction que celle dans laquelle il a été chargé. Cela rend le matériau de remplissage moins important en termes de sélectivité globale car le chemin du débit est plus court, mais cela signifie également que les matières insolubles ont la possibilité d'être relarguées hors du piège et dans votre colonne Micro LC. Vous pouvez également bénéficier de l'utilisation d'un piège à DI plus large, qui peut être chargé à un débit plus rapide, ce qui accélère cette étape si le temps est un facteur important pour l'analyse de votre application.

cut away of lc system pump for reverse flow

Débits typiques

Pour les colonnes de 1 mm de diamètre intérieur, le débit typique est de 1-75 µL/min

Chargement

Charge d'échantillon typique µg

Qu'est-ce qui se cache sous ces noms? - Déchiffrer le code des dibenzodioxines et des dibenzofuranes

Les dioxines et les furanes sont des composés toxiques qui sont persistants dans l'environnement, mais d'où proviennent-ils et comment surveillons-nous la diversité des analogues associés à ces composés ? Dans le cadre des analyses environnementales, les "dioxines" et les "furanes" désignent spécifiquement les dibenzodioxines polychlorées (composés PCDD) et les dibenzofuranes polychlorés (composés PCDF). Ces composés sont des polluants organiques persistants (composés POP) qui ont une affinité pour un facteur de transcription appelé récepteur d'aryl hydrocarbone. Nous ne parlons pas ici des composés dioxane, dioxine, furane ou tétrahydrofurane (THF) observés au cours d'une série de tests "dioxines et furanes". Les discussions sur les POP entre les scientifiques de l'environnement peuvent sembler difficile à suivre pour les nouveaux venus, étant donné l'étendue des connaissances de base supposées et les abbréviations par lesquels ces composés sont désignés. Nous allons présenter l'importance des tests "dioxines et furanes" en abordant l'origine et la nomenclature de ces POP.

Les polluants PCDD "dioxines" ont un passé historique, et sont connus comme des sous-produits de la production d'herbicides tels que le 2,4,5-T (acide 2,4,5-Trichlorophénoxyacétique) et le 2,4-D (acide 2,4-Dichlorophénoxyacétique), qui ensemble constituent l'Agent Orange. Ces herbicides ont eux-mêmes un profil de toxicité, mais les sous-produits dioxines sont beaucoup plus toxiques. Historiquement, les sous-produits dioxines n'ont pas été surveillés pendant la production ou l'utilisation de ces herbicides en raison d'un manque de sensibilisation à la toxicité intense des dibenzodioxines polychlorées. L'utilisation à grande échelle de ces herbicides et les accidents industriels qui ont eu lieu dans le passé ont entraîné une contamination persistante de l'environnement par les dioxines.

Un intermédiaire critique lors de la synthèse des herbicides polychlorés à base de phényle est un phénolate polychloré, qui est sujet à des réactions secondaires produisant des composés PCDD. Les phénols polychlorés sont eux-mêmes des pesticides susceptibles de générer des PCDD. Aujourd'hui, les polluants PCDD et PCDF sont également surveillés en tant que sous-produits de la combustion incomplète des ordures ménagères ou de quantités plus importantes d'ordures destinées aux décharges. L'analyse isotopique peut être utilisée pour corréler les résultats d'analyse des dioxines avec la source ou le lieu d'origine des PCDD ou PCDF. Les polluants "furanes" PCDF peuvent résulter de diverses réactions oxydatives sur les composés polychlorobiphényles (PCB). Les composés PCB sont eux-mêmes toxiques et sont des composés diélectriques couramment utilisés dans les condensateurs électriques, ce qui explique leur omniprésence dans les décharges.

"J'essaie de séparer mon 1238 de mon 2378 !"
On peut traduire cela en numérotant d'abord les positions autour des composés dibenzo auxquels les chlorines peuvent se lier. Notez que les carbones tertiaires ne sont pas numérotés. Faites attention lorsque vous parlez de dibenzodioxines polychlorées (PCDD) et de dibenzodioxines polychlorées (PCDF). Ensuite, il faut considérer le préfixe qui indique le nombre de chlorines liées au composé dibenzo. Les méthodes environnementales concernent généralement les PCDD et les PCDF dont le chlore a quatre substituts ou plus, dont les préfixes et abréviations sont indiqués dans le tableau 1. Les analogues "octa-chlorés" ne nécessitent pas de numérotation, car toutes les positions des substituants sont liées à un substituant chloré.

Tableau 1 - Exemples de PCDD et PCDF
Nombre de substituts Cl	Exemples
(4) Tetra – T	Exemple : dioxin (PCDD) Nom : 2,3,7,8-TCDD
(5) Penta – Pe	Exemple : dioxin (PCDD) Nom : 1,2,3,7,8-PeCDD
(6) Hexa – Hx	Exemple : furan (PCDF) Nom : 1,2,3,4,6,8-HxCDF
(7) Hepta – Hp	Exemple : dioxin (PCDD) Nom : 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD
(8) Octa – O	Exemple : furan (PCDF) Nom : OCDF

Les composés PCDD et PCDF sont souvent désignés par la nomenclature présentée dans le tableau 1. Il arrive, lors d'analyses de routine, que ces composés soient simplement désignés par la position des substituts de chlore, par exemple "séparer un 1238 d'un 2378". Précisez que le contexte concerne spécifiquement les composés PCDD ou PCDF, en particulier lorsque vous vous adressez à des membres d'autres laboratoires ou organisations.

Nous devons remercier les scientifiques et les techniciens de laboratoire qui analysent les échantillons environnementaux pour identifier les composés PCDD et PCDF, ainsi que les herbicides et les composés PCB associés. Nous espérons avoir dissipé l'ambiguïté qui peut entourer l'analyse des "dioxines et furanes" pour ceux qui abordent ce thème pour la première fois.

Heaton, A.: 1996, ‘Pesticides’, in: Heaton, A. (ed.), The Chemical Industry, Blackie Academic & Professional, London, pp. 238-43.

Crosby DG, Moilanen KW, Wong AS. Environmental Generation and Degradation of Dibenzodioxins and Dibenzofurans. Environ Health Perspect. 1973;5:259-266. doi:10.1289/ehp.7305259

Pourquoi ma récupération est-elle supérieure à 100 % ?

Lorsque nous effectuons l'extraction d'un analyte en SPE, nous nous attendons à une récupération de 100 %. Si la récupération est plus faible, cela suggère qu'il y a un problème de récupération de l'analyte à partir du sorbant, mais quelles sont les raisons pour lesquelles vous pouvez constater une récupération supérieure à ce que vous attendiez (ou supérieure à 100 %) ?

Problèmes communs

Interférences de coélution
Contaminants du solvant ou des sorbants sélectionnés
Problème d'étalon interne, rendant votre point de référence inexact
Calculs de récupération inexacts

Interférences de coélution : elles sont généralement présentes dans la matrice et l'objectif de la SPE est de les éliminer. Si la récupération est supérieure à 100 %, la première étape consiste à vérifier l'éluant en utilisant une technique d'analyse orthogonale pour identifier que l'augmentation de la récupération est le résultat d'une coélution. Lorsqu'une coélution est identifiée, il y a plusieurs solutions possibles.

Modifiez les étapes de lavage de la méthode SPE pour éliminer sélectivement l'impureté pendant le lavage.
Choisissez un autre sorbant SPE qui permettra de mieux éliminer ces impuretés. Cela est plus facile si l'analyte / l'impureté peut être sélectivement ionisé car un sorbant échangeur d'ions permet très vite d'obtenir des extraits plus propres que les solutions en phase normale ou inverse.
Ajustez votre méthode d'analyse pour séparer les deux pics analytiquement, ce qui supprime la nécessité d'éliminer cette impureté pendant l'étape de SPE.
Analysez un échantillon de plasma à blanc, cela vous permettra de déterminer les impuretés présentes. Utilisez ce blanc dans les calculs pour le soustraire de votre récupération.

Contaminants provenant du solvant ou du sorbant : il s'agit généralement d'impuretés présentes dans les matières premières qui sont de nature similaire à votre composé cible et qui, par conséquent, coéluent avec lui lors de l'étape de SPE et de l'analyse. Vous pouvez suivre les étapes ci-dessus pour éliminer les impuretés de coélution ou, comme il ne s'agit pas d'une impureté présente dans votre matrice, vous pouvez identifier la quantité présente dans le sorbant en utilisant des essais à blanc et le soustraire de votre pic principal pendant le calcul. Avant d'ajouter votre échantillon, vous pouvez équilibrer votre sorbant avec le solvant d'élution ; cela devrait éliminer les contaminants potentiels du sorbant avant d'ajouter l'échantillon. Pour les impuretés issues du solvant, le fait de changer de solvant devrait résoudre ce problème.

Etalon interne compromis : si votre étalon interne n'indique pas une récupération de 100 %, vos calculs ultérieurs seront inexacts. Il est toujours recommandé d'utiliser un étalon interne de même nature que votre composé cible, car cela donnera un point de référence plus fiable pour votre méthode. Si votre étalon interne n'indique pas une bonne récupération en SPE selon votre méthode, vous pouvez utiliser un étalon externe qui est ajouté au solvant d'élution pour calculer la récupération absolue.

Les calculs de recouvrement sont inexacts : cette étape est importante pour déterminer où les erreurs apparaissent.

Erreurs de calcul - vérifiez tous les calculs et tenez compte de tous les facteurs de dilution.
Erreurs d'intégration - réintégrez tous les pics et utilisez des calculs manuels pour vérifier.
Erreurs de méthode d'analyse - assurez-vous que la méthode d'analyse utilisée permet une intégration et un calcul corrects. Assurez-vous qu'aucun solvant fort n'est utilisé pour l'injection et effectuez un étalonnage sur un certain nombre de dilutions pour garantir la linéarité. Vérifiez votre méthode d'analyse pour déterminer les facteurs qui peuvent entraîner une mauvaise reproductibilité
Assurez-vous que les paramètres de détection sélectionnés sont appropriés et fonctionnent correctement.