Technischer Tipp zur Probenvorbereitung
Niveau: Mittel
Probenvorbereitung für N-gebundene Glykane
Die Verwendung einer Probenvorbereitungsplatte zur Reinigung von N-gebundenen Glykanen, die von Glykoproteinen getrennt wurden
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Probenvorbereitungsplatten haben sich als erfolgreich beim Ersatz von intensiveren Probenvorbereitungsverfahren erwiesen, die auf die Spaltung von Glykanen aus Glykoproteinen mittels PNGase F-Aufschluss folgen. Es ist unerlässlich, die N-Glykane vor der Quantifizierung durch HPLC-UV oder LC-MS/MS zu markieren. Eher herkömmliche Aufreinigungsmethoden sind zeitaufwändig und enthalten mehrere Schritte, die die Fehlerrate erhöhen können. Die Reinigung mit einem HILIC-Produkt für die Festphasenextraktion (SPE), wie z.B. BiozenTM-N-Glycan Clean-Up Mikroelutionplatten, bietet im Vergleich empfindliche, effektive und zeitnahe Ergebnisse. Im Folgenden skizzieren wir den Glykan-Workflow.
Glykoproteinproben werden mit reinem Wasser auf 2 mg/ml rekonstituiert und durch Zugabe von 6 µl Tensid und Erhitzen auf 90 °C für 3 Minuten denaturiert. Es werden 1,2 µl PNGase F zugegeben und die Proben 5 Minuten bei 50 °C inkubiert.
Dieser Schritt dient der Abspaltung der Glykane von ihrem Glykoprotein
Die Markierung erfolgt dann entweder mit 2- Aminoessigsäure (2-AA) oder 2- Aminobenzoesäure (2-AB) unter Verwendung der freigesetzten Glykane, die mit 12 μl Markierungsreagenzlösung pro Probe hergestellt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden.
Nach der Fluoreszenzmarkierung muss der Farbstoff entfernt werden, da dieser im Überschuss vorhanden ist, wie es bei jedem Derivatisierungsschritt üblich ist. Hierfür wird eine HILIC SPE-Platte bevorzugt.
Die Reinigung wird dann mit der HILIC SPE-Platte gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt.
| 96-Well-Plate | Biozen N-Glykan-Reinigung |
|---|---|
| Konditionieren | 200µl Wasser |
| Equilibrieren | 200µl Wasser /ACN (15:85) |
| Laden | Probe |
| Waschen | 2 x 600µl Ameisensäure / Wasser / ACN (1:9:90) |
| Eluieren | 3 x 30µl 200mM Ammoniumacetat in ACN / Wasser (5:95) |
| Verdünnen | 100µl Dimethylforamid und 210µl ACN |
Bei diesem Schritt werden die Glykane in wässrigem Puffer eluiert, jedoch ist deren HPLC-Trenntechnik üblicherweise HILIC, und ein wässriges Verdünnungsmittel würde ein starkes Lösungsmittel für eine HILIC-Methode darstellen, so dass sie nicht ideal ist. Aus diesem Grund sind Mikroelutionsplatten die bevorzugte Plattform für die Reinigung, um die Menge des wässrigen Puffers in der Probe zu minimieren und den starken Lösungsmitteleffekt für die nachfolgende Analyse zu reduzieren. Wenn sie auf diese Weise vorbereitet sind, sind diese markierten Glykanproben bereit für die Analyse mit einer Glykan-Analysesäule.
Probenreinigung nach Freisetzung und Markierung von N-verknüpften Glykanen mit der Biozen N-Glycan Clean-Up HILIC SPE Microelution 96-Well Plate
In diesem technischen Hinweis werden zwei Glykan Reinigungslösungen für ein handelsübliches In-Solution-Verdauungs- und Markierungskit zur Erstellung von Glykanprofilen eines Trastuzumab-Biosimilars und eines stark sialylierten Glykoproteins (alpha-1 saures Glykoprotein, AGP) verglichen. Biozen N-Glycan Clean-Up ist ein HILIC-Festphasenextraktionsprodukt in einer Mikroelutionsplatte mit 96 Vertiefungen, das eine hervorragende Retention und Wiedergewinnung von markierten, freigesetzten n-Glykanen aufweist.
Marke
Biozen ist eine Marke von Phenomenex.
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
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