Wskazówka techniczna dotycząca przygotowania próbki
Poziom: Intermediate
Przygotowanie próbki dla N-związanych glikanów
Zastosowanie płytki do przygotowywania próbek do oczyszczania N-związanych glikanów odciętych z glikoprotein
Płytki do przygotowywania próbek okazały się skuteczne w zastępowaniu bardziej skomplikowanych procesów przygotowywania próbek po odcięciu glikanów z glikoprotein za pomocą trawienia PNGazą F. Oznaczenie N-glikanów jest istotne przed oznaczeniem ilościowym interesującej nas biocząteczki za pomocą HPLC-UV lub LC-MS/MS. Te bardziej tradycyjne metody oczyszczania są czasochłonne i zawierają wiele etapów, które mogą zwiększyć błąd. Oczyszczanie przy użyciu produktu do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) typu HILIC, takiego jak płytki do mikroelucji BiozenTM-N-Glycan Clean-Up, oferuje w porównaniu z nimi czułe, skuteczne i szybkie wyniki. Poniżej przedstawiamy protokół postępowania z glikanami.
Próbki glikoprotein są rekonstytuowane do 2 mg/ml czystą wodą i denaturowane przez dodanie 6 µl środka powierzchniowo czynnego i podgrzanie do 90°C przez 3 minuty. Dodaje się 1,2 µl PNGazy F i inkubuje próbki przez 5 minut w temperaturze 50°C.
Ten etap służy do odcięcia glikanów od ich glikoprotein.
Uwolnione glikany są znakowane. Znakowanie jest wykonywane przy użyciu kwasu 2-aminooctowego (2-AA) lub kwasu 2-aminobenzoesowego (2-AB). Do próbki dodaje się 12 μL roztworu odczynnika do znakowania na próbkę i inkubuje przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
Po znakowaniu fluorescencyjnym, znacznik musi zostać usunięty, ponieważ jest w nadmiarze, jak to zwykle bywa na każdym etapie derywatyzacji. W tym celu preferowana jest płytka HILIC SPE.
Oczyszczanie jest następnie przeprowadzane przy użyciu płytki w trybie HILIC SPE zgodnie z poniższą procedurą.
| Płytka 96-dołkowa | Biozen N-Glycan Clean-Up |
|---|---|
| Kondycjonowanie | 200 µl wody |
| Równoważenie | 200 µl woda/CAN (15:85) |
| Nanoszenie | Próbka |
| Przemywanie | 2 x 600 µl kwasu mrówkowego / wody / ACN (1:9:90) |
| Elucja | 3 x 30 µl 200 mM octanu amonu w ACN/wodzie (5:95) |
| Rozcieńczanie | 100 µl dimetyloforamidu i 210 µl ACN |
W tym procesie glikany są eluowane w roztworze wodnym, jednak techniką separacji HPLC jest zwykle metodą HILIC, a woda stanowił silny rozpuszczalnik dla metody HILIC, co kreuje komplikacje. Z tego powodu preferowaną platformą do oczyszczania są mikropłytki elucyjne, aby zminimalizować ilość roztworu wodnego w próbce i zmniejszyć efekt silnego rozpuszczalnika do późniejszej analizy. Przygotowane w ten sposób próbki znakowanych glikanów są gotowe do analizy przy użyciu kolumny Biozen Glycan.
Sample Clean-Up After N-Linked Glycan Release and Labeling Using Biozen N-Glycan Clean-Up HILIC SPE Microelution 96-Well Plate
Niniejsza nota aplikacyjna porównuje dwa sposoby oczyszczania glikanów dla dostępnego na rynku zestawu do trawienia i znakowania w roztworze do profilowania glikanów dla próbki biopodobnego trastuzumabu i silnie sialilowanej glikoproteiny (alfa-1 kwaśna glikoproteina, AGP). Biozen N-Glycan Clean-Up to produkt do ekstrakcji do fazy stałej w trybie HILIC na 96-dołkowej płytce do mikroelucji, który charakteryzuje się doskonałą retencją i odzyskiem znakowanych, uwolnionych n-glikanów.
Znaki towarowe
Biozen jest znakiem towarowym firmy Phenomenex.
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
CONNECT WITH US
