Suggerimento Tecnico per la Preparazione del Campione
Livello: Intermedio
La preparazione del campione per Glicani “N-linked"
Come utilizzare una piastra per la preparazione di campioni a base di glicani N-linked, idrolizzati da glicoproteine
L'uso di piastre per la preparazione del campione nell’analisi dei Glicani “N-linked" rilasciati dalle glicoproteine.
Le piastre di preparazione del campione si sono dimostrate efficaci nella sostituzione di processi di pulizia del campione che seguono la l’idrolisi dei glicani dalle glicoproteine con PNGase F. È essenziale modificare gli N-glicani prima dell’analisi quantitativa mediante HPLC-UV o LC-MS/MS; questi metodi di pulizia sono dispendiosi in termini di tempo, richiedono più passaggi e pertanto possono introdurre più errori. La pulizia utilizzando un prodotto di estrazione in fase solida HILIC (SPE), come le piastre “micro-elution” BiozenTM-N-Glycan Clean-Up, garantisce risultati sensibili, efficaci e veloci. Di seguito il protocollo consigliato per l’analisi dei glicani.
Le glicoproteine sono ri-disciolte in acqua pura alla concentrazione di 2 mg/mL, denaturate aggiungendo 6 µL di tensioattivo e riscaldando a 90°C per 3 minuti. Successivamente si aggiungono 1,2 µL di PNGasi F ed il campione viene incubato per 5 minuti a 50°C.
Questo passaggio serve a scindere i glicani dalla loro glicoproteina.
I glicani rilasciati a seguito dell’idrolisi vengono modificati aggiungendo al campione 12 μL di soluzione del reagente di labeling ed incubati per 5 minuti a temperatura ambiente. Il labeling può essere effettuato sia con acido 2-aminoacetico (2-AA) che con acido 2-aminobenzoico (2-AB).
Terminata la procedura di labeling, il colorante in eccesso deve essere rimosso, come in qualsiasi procedura di derivatizzazione. Per questo è preferibile utilizzare una piastra SPE HILIC.
Il clean up è effettuato utilizzando una piastra SPE HILIC SPE in accordo con la procedura riportata sotto.
| 96-Well Plate | Biozen N-Glycan Clean-Up |
|---|---|
| Condizionamento | 200µL di Acqua |
| Equilibrazione | 200µL Acqua/ACN (15:85) |
| Caricamento | Campione |
| Lavaggio | 2 x 600µL Acido Formico/Acqua/ACN(1:9:90) |
| Eluizione | 3 x 30µL 200mM Ammonio Acetato in ACN/Acqua (5:95) |
| Diluizione | 100µL di DMF e 210µL di ACN |
L’eluizione porta i glicani in un tampone acquoso, tuttavia essendo successivamente analizzati mediante cromatografia HILIC è opportuno ridurre la forza eluente del solvente di caricamento. Per questo motivo, le piastre “micro-elution” rappresentano la piattaforma ideale per il clean-up, in quanto si utilizza una minima quantità di tampone acquoso nel campione, cosa che riduce l'effetto del solvente forte nella successiva analisi. Quando preparati in questo modo, i glicani marcati sono pronti per la successiva analisi cromatografica.
Sample Clean-Up After N-Linked Glycan Release and Labeling Using Biozen N-Glycan Clean-Up HILIC SPE Microelution 96-Well Plate
Questa nota applicativa confronta due soluzioni di “clean-up” dei glicani di un biosimilare del trastuzumab e di una glicoproteina fortemente sialilata (glicoproteina acida alfa-1, AGP) mediante l'utilizzo di un kit commerciale di digestione e marcatura in soluzione. Biozen N-Glycan Clean-Up è un prodotto di estrazione in fase solida HILIC (piastra a 96 pozzetti) che offre un'eccellente ritenzione e recupero dei N-glicani.
Marchi commerciali
Biozen è un marchio di proprietà di Phenomenex.
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
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