Suggerimento tecnico HPLC/UHPLC
Livello: Base
Sviluppare metodi analitici di successo per l'analisi dei peptidi usando un approccio sistematico
Panoramica
Nello sviluppo metodo LC, i peptidi sono spesso considerati come piccole molecole pur rappresentando il collegamento in termini di complessità tra prodotti farmaceutici tradizionali e biomolecole più grandi come le proteine. Nella analisi di peptidi, non possiamo semplicemente considerare solo le proprietà degli aminoacidi che li compongono, ma anche la sequenza e composizione stessa del polipeptide, il suo ingombro sterico e la sua struttura nello spazio (folding). Per questi motivi, le loro proprietà in analisi LC differiscono molto dalle piccole molecole.
Suggerimento
Lo sviluppo metodo per analisi di peptidi dovrebbe iniziare con un processo di screening di fasi stazionarie idrofobiche di differente selettività. Se il profilo ottenuto non fornisce la selettività desiderata, è necessario passare a una fase alternativa e ortogonale.
Pendenza e tipo di gradiente sono molto importanti per l'analisi dei peptidi; i gradienti hanno una pendenza meno ripida rispetto a quelli utilizzati per le piccole molecole. Per l'ottimizzazione del gradiente, consigliamo di iniziare con una bassa % B per focalizzare i peptidi in testa alla colonna, impostando una pendenza di 1% B al minuto fino al 50-60% organico, valori nei quali tutti i peptidi dovrebbero eluire. Il pH ottimale dovrà essere ricercato in base alle caratteristiche chimico-fisiche del peptide, e influenzerà sia la carica residua che la ritenzione del peptide stesso. Infine, andrà valutata anche forza e natura del solvente organico, che è tipicamente acetonitrile.
Una volta effettuato lo screening iniziale, è possibile eseguire l'ottimizzazione del metodo modificando altri parametri (Fig. 1). Il parametro più importante da considerare è l’effetto del pH in termini di selettività e ritenzione. (Fig. 2)
Fig. 1
| Variabile | Soluzione |
|---|---|
| Flusso | Incidenza limitata in analisi di peptidi rispetto all'impatto che ha su piccole molecole |
| pH | Piccole variazioni possono avere un enorme impatto su ritenzione, risoluzione e forma del picco |
| Pendenza del gradiente | Il cambio di gradiente può avere un effetto importante sulla selettività |
| Temperatura | 40-90⁰C |
| Tipologia tampone / Concentrazione | La fase mobile tipicamente include TFA, Acido Formico, HFBA e/o tampone fosfato |
Fig. 2
Colonna: Kinetex EVO C18 5µm
Dimensioni: 250 x 4.6mm
MP A: 50mM ammonio acetato in acqua; Acetonitrile (v/v 97:3), vari pH
MP B: 50mM ammonio acetato in acqua: Acetonitrile (v/v 60:40), vari pH
Flusso: 1.5 mL/min
Gradiente: 14-34% B, 40 minuti, lavaggio rapido fino 80%
Detection: UV-Vis @ 220nm
Temperatura: 65oC
Campione: peptide sintetico di 12 AA con relative impurezze
Le fasi stazionarie svolgono un ruolo importante nel processo di sviluppo ed è consigliabile esplorare diverse selettività ortogonali (Fig. 3).
| Colonna | Esempio | Proprietà | Peptidi |
|---|---|---|---|
| Primary C18 | KinetexTM EVO C18 | Stabile a pH alto | Profilo impurezze / stereoisomeri del petpide |
| C18 ortogonale | BiozenTM Peptide PS-C18 | C18 a modalità mista | Peptidi basici, peptidi polari |
| C8 | Kinetex C8 | Diversa densità di legame | Peptidi molto idrofobici, selettività ortogonale alla C18 |
| Fenilica/aromatica | Kinetex Biphenyl | Selettività aromatica unica, con selettività sterica e modaratamente idrofobica | Peptidi molto idrofobici, peptidi ciclici, peptidi con analli aromatici |
Conclusione
Lo sviluppo metodo sistematico per l'analisi dei peptidi sintetici ti consentirà di quantificarli e purificarli dalle loro impurezze in un processo robusto e affidabile. Lo screening della selettività colonna e pH ottimale sono di fondamentale importanza per la bontà e robustezza del metodo LC. Seguire un approccio Quality by Design semplifica questa strategia e consente di valutare insieme tutte queste variabili durante lo sviluppo del metodo.
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