Astuce technique LC
Niveau : débutant
Approche systématique pour l'analyse des peptides
Aperçu
Les peptides sont souvent considérés comme de petites molécules pour les analyser lors du développement de méthodes chromatographiques. Cependant, ils se situent, en termes de poids moléculaire, entre les petites molécules, comme les produits pharmaceutiques traditionnels, et les plus grandes biomolécules, comme les protéines. Lorsque vous analysez les peptides, il ne faut pas considérer seulement les propriétés des acides aminés qui les composent, car leurs caractéristiques dépendent non seulement de ces éléments, mais également de la séquence de liaison en une chaîne peptidique et également de la façon dont les chaînes peptidiques sont enroulées ou repliées dans l'espace. Pour cette raison, les peptides ne se comportent pas à de nombreux égards comme de petites molécules lorsque vous les analysez sur une colonne HPLC.
Astuce
Le développement initial de méthode devrait commencer par un procédé de screening chimique. Le screening de nombreuses phases stationnaires commence par une phase alkyle typique. Si le profil que vous obtenez ne donne pas la sélectivité souhaitée, vous devriez passer à une autre phase ayant idéalement des propriétés chimiques très différentes.
Les gradients sont également importants pour l'analyse des peptides. Ils sont généralement beaucoup moins forts par rapport aux gradients pratiqués lors de l’analyse de petites molécules. Pour l'optimisation du gradient lors de l'analyse des peptides, nous recommandons d’utiliser initialement un faible %B afin de concentrer les peptides en tête de colonne. Une légère pente jusqu'à 50-60% organique est recommandée, à laquelle tous les peptides doivent éluer (typiquement 1% B par minute). Le pH devrait également être pris en compte car il affecte les propriétés physicochimiques du peptide et, par conséquent, son temps de rétention. La nature de votre solvant d’élution est généralement l’acétonitrile.
Une fois que vous avez effectué votre screening initial, vous pouvez vous consacrer à l’optimisation de méthode en changeant d’autres paramètres (Fig. 1). Celui ayant l’impact le plus significatif sur la sélectivité est le pH (Fig. 2).
Fig. 1
| Variable | Solution |
|---|---|
| Débit | Moins puissant pour les peptides que pour les petites molécules |
| pH | Une gamme étroite peut avoir un impact important |
| Pente du gradient | Le gradient change considérablement la sélectivité |
| Température | 40-90⁰C |
| Type de tampon / concentration | De nombreuses solutions, y compris le TFA, acide formique, HFBA, tampons de phosphate |
Fig. 2
Colonne : Kinetex EVO C18 5µm
Dimensions : 250 x 4,6mm
MP A : Acétate d’ammonium 50mM dans l’eau ; Acétonitrile (v/v 97:3), pH comme indiqué
MP B : Acétate d’ammonium 50mM dans l’eau : Acétonitrile (v/v 60:40), pH comme indiqué
Débit : 1,5 ml/min
Programme du gradient : 14-34% B, 40 minutes, rampe à 80%
Détection : UV-Vis à 220nm
Température : 65oC
Échantillon : Peptide synthétique de 12 AA avec des impuretés synthétiques apparentées
Les phases stationnaires jouent un rôle important dans le processus de développement. Il est recommandé d’explorer des chimies différentes de colonne (Fig. 3).
| Colonne | Example | Propriétés | Groupes de peptides |
|---|---|---|---|
| C18 primaire | KinetexTM EVO C18 | Haute stabilité au pH | Profil d’impuretés, y compris les impuretés stéréoisomères peptidiques |
| C18 alternative | BioZenTM Peptide PS-C18 | C18 en mode mixte | Peptides basiques Peptides polaires |
| C8 | Kinetex C8 | Densité de liaison différente | Peptides très hydrophobes. Sélectivité orthogonale à la C18 |
| Aromatique / Phényle | Kinetex Biphenyl | Unique hydrophobic arylene and polar selectivity | Peptides très hydrophobes Peptides cycliques Peptides à chaines latérales aromatiques |
Conclusion
Une approche systématique de développement de méthode robuste et fiable pour l’analyse de peptides synthétiques vous permettra de quantifier et de purifier avec précision les peptides, et les séparer de leur impuretés synthétiques et diastéréoisomères. Le screening des chimies de colonne et le pH sont très importants. Un système bien tamponné et contrôlé est un atout. Suivre un processus Quality by Design simplifie cette stratégie en rassemblant tous les éléments importants lors du développement de votre méthode.
Poster de sélectivité HPLC
Laissez le poster de sélectivité HPLC vous montrer comment séparer les :
• Composés hydrocarbonés
• Fonctionnalités contenant des groupes hydroxyle ou amine
• Isomères, composés isobariques et sélectivité de forme
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