HPLC/UHPLC Technischer Tipp
Niveau: Grundlagen
Ein systematischer Ansatz zur Peptidanalyse
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Überblick:
Peptide werden häufig als kleine Moleküle betrachtet, wenn es darum geht, chromatographische Methoden für Ihre Analyse zu entwickeln. Sie schließen jedoch die Lücke zwischen kleinen Molekülen wie traditionellen Pharmazeutika und größeren Biomolekülen wie Proteinen. Bei deren Analyse kann man nicht einfach die Eigenschaften ihrer Aminosäuren berücksichtigen, da Ihre Eigenschaften nicht nur von diesen Bausteinen abhängig sind, sondern auch von der Bindungssequenz in der Peptidkette und auch von der Art und Weise, wie die Peptidketten im Raum geknäult oder gefaltet sind. Aus diesem Grund verhalten sich Peptide in vielerlei Hinsicht nicht wie kleine Moleküle, wenn Sie sie auf einer HPLC-Säule analysieren.
Tipp
Die anfängliche Methodenentwicklung für Peptide sollte mit einem ScreeningProzess beginnen, bei dem verschiedene stationäre Phasen überprüfen werden sollten, beginnend mit einer typischen Alkylphase. Wenn das von Ihnen erzielte Peptid-Profil nicht die erwünschte Selektivität zeigt, sollten Sie eine alternative stationäre Phase benutzen, idealerweise mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften.
Gradienten sind auch für die Peptidanalyse wichtig und normalerweise werden viel flachere Gradienten als bei der Analyse von kleinen Molekülen eingesetzt. Um die Gradienten bei der Peptidanalyse zu optimieren, empfehlen wir, bei einem niedrigen %BWert anzufangen, um die Peptide am Säulenkopf zu fokussieren. Bei einer geringen Gradientensteigung (1% B pro Minute ist typisch) bis zu einem Endwert von 50-60% Organik sollten alle Peptide eluieren. Der pH-Wert sollte ebenfalls berücksichtig werden, weil er die physiochemischen Eigenschaften von Peptiden und somit deren Retentionszeit beeinflusst. Schließlich sollten Sie die Art Ihres Elutionslösungsmittels berücksichtigen, welches für Peptide typischerweise Acetonitril ist.
Nachdem Sie Ihr anfängliches Screening durchgeführt haben, können Sie mit der Methodenoptimierung durch Ändern anderer Methodenparameter anfangen (Abb. 1). Der Parameter, der die deutlichsten Auswirkungen auf die Selektivität hat, ist der pH-Wert (Abb 2).
Abb. 1
| Variable | Lösung |
|---|---|
| Flussrate | Für Peptide weniger stark als für kleine Moleküle |
| pH | Ein enger Bereich kann große Auswirkungen haben |
| Steigung des Gradientes | Gradientenänderungen haben einen großen Einfluss auf die Selketivität |
| Temperatur | 40-90⁰C |
| Puffertyp / Konzentration | Viele Lösungen, einschließlich TFA, Ameisensäure, HFBA, Phosphatpuffer |
Abb. 2
Säule: Kinetex EVO C18 5µm
Abmessungen: 250 x 4.6mm
MP A: 50mM Ammoniumacetat in Wasser; Acetonitril (v/v 97:3), verschiedene pH Werte
MP B: 50mM Ammoniumacetat in Wasser; Acetonitril (v/v 60:40), verschiedene pH Werte
Flussrate: 1.5 mL/min
Gradientenprogramm: 14-34% B über 40 Minuten, Anstieg auf 80%
Detektion: UV-Vis bei @ 220nm
Temperatur: 65°C
Probe: 12 AA synthetisches Peptid mit synthetisch verwandten Verunreinigungen
Stationäre Phasen spielen eine wichtige Rolle im Entwicklungsprozess, und es wird empfohlen, verschiedene Säulenchemien zu erkunden (Abb. 3).
Abb. 3
| Säule | Beispiel | Eigenschaften | Peptidegruppe |
|---|---|---|---|
| Herkommliche C18 | KinetexTM EVO C18 | Hohe pH-Stabilitität | Verunreinigungsprofil Stereoisomerer Peptidverunreinigungen |
| Alternative C18 | BioZenTM Peptide PS-C18 | Mixed-Mode C18 | Basische Peptide Polare Peptide |
| C8 | Kinetex C8 | Unterschiedliche Ligandendichte | Sehr hydrophobe Peptide Orthogonale Selektivität C18 |
| Aromatic / Phenyl | Kinetex Biphenyl | Einzigartige hydrophobe Anylen und polare Selektivät | Sehr hydrophobe Peptide Cyclishe Peptide Peptide mit aromatischen Seitenketten |
Fazit
Ein systematischer Ansatz bei der Methodenentwicklung für die Analyse von synthetischen Peptiden erlaubt es Ihnen, Peptide in einem robusten und zuverlässigen Prozess genau zu quantifizieren und von ihren synthetischen Verunreinigungen und Diastereomeren abzutrennen. Das Screening von verschiedenen stationären Phasen und des pH-Werts ist extrem relevant und ein gut gepuffertes und kontrolliertes System ist ein Muss
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