Technischer Tipp zur Probenvorbereitung
Niveau: Mittel
SPE Troubleshooting
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In diesem technischen Tipp beschäftigen wir uns mit einigen Problemen bezüglich der Wiederfindung von Analyten in der SPE. Die Wiederfindung ist der Prozentanteil des Analyten der im Rahmen der SPE gesammelt bzw. gefunden wird. Einige in diesem Zusammenhang verbreitete Begriffe/Definitionen sind:
Relative Wiederfindung: Indirekte Bestimmung der Sammlung und Wiederfindung des Analyten während des Extraktionsprozesses basierend auf der Wiederfindung eines internen Standards (eine Verbindung mit ähnlicher Struktur des Analyten), der zur Probe/Matrix vor der eigentlichen Extraktion hinzugefügt wird.
Absolute Wiederfindung: Quantitative Methode zur Bestimmung der wirklichen Menge an Analyt, die während der Extraktion gesammelt und wiedergefunden wird. Die Wiederfindung des Analyten basiert auf einem externen Standard, der nach der Extraktion dem Eluat hinzugefügt wird (im Gegensatz zu einem internen Standard, der mit dem Analyt koextrahiert wird).
Symptom
Die Wiederfindung des Analyten ist kleiner als 100 %
Hinweis
Die Analyse der nicht retinierten Fraktion (Totvolumen) zeigt, dass der Analyt im „Durchfluss“ enthalten ist
Problem
Die Bindung des Analyten erfolgt während des Beladungsschritts nicht quantitativ
| Ursache | Lösungen/ Vorschläge |
|---|---|
| A. Die Konditionierung der Kartusche ist fehlerhaft, falsch oder nicht optimiert | 1. Konditionieren Sie die Kartusche mit Methanol oder Isopropanol 2. Verwenden Sie ausreichende Mengen Methanol oder Isopropanol, um das gesamte Sorbensbett zu benetzen. Lassen Sie hierfür mehr als zwei Säulenvolumina langsam unter geringem Vakuum durch die Kartusche fließen 3. Lassen Sie direkt nach dem Methanol oder Isopropanol ein Säulenvolumen einer Lösung mit ähnlicher Zusammensetzung der aktuellen Probe (eingestellter pH) aber ohne den/die Analyt(en) ins Sorbensbett fließen 4. Verwenden Sie unter (3) nicht zuviel dieses „zweiten Konditionierungslösungsmittels“ oder lassen Sie es nicht zu lang in der Kartusche verbleiben 5. Trocknen Sie die Kartusche während oder nach dem Konditionieren nicht zu stark. Verwenden Sie für ca. 1 Minute geringes Vakuum) |
| B. Die Probe/Matrix ist in einem „zu starken“Lösungsmittel gelöst (oder enthält ein „zu starkes“Lösungsmittel) | 1. Verdünnen Sie die Probe in einem „schwächeren“ Lösungsmittel, um die Bindung zu fördern (weniger polar für Normalphase, polarer für Reversed Phase, weniger Salz, gepuffert und/oder eingestellter pH für Ionenaustausch 2. Erhöhen Sie die Verdünnung der Probe mit einem „schwachen“ Lösungsmittel 3. Tragen Sie weniger Probe auf 4. Erhöhen Sie die Sorbens-masse 5. Reduzieren Sie während des Beladens die Flussrate 6. Verwenden Sie ein „stärkeres“ Sorbens mit einer höheren Affinität gegenüber dem Analyten 7. Fügen Sie einen organischen Modifier hinzu oder passen Sie den pH an,um die Bindungs-affinität gegenüber den/dem Analyten zu erhöhen 8. Passen Sie den pH der Probe so an, dass der Analyt neutral für die Reversed Phase oder geladen für den Ionenaustausch ist 9. Fügen Sie Salz (5 bis 10 % NaCl) hinzu, um die Polarität des Solvens zu erhöhen und die Retention stark polarer Analyten unter Reversed Phase zu erhöhen 10. Fügen Sie ein Ionenpaarreagenz hinzu, um die Bindung geladener Analyten unter Reversed Phase zu verbessern |
| C. Massenüberladung“ der Kartusche (die Kartusche ist zu klein und/oder die Gesamtmasse an gebundenen Verbindungen ist zu groß | 1. . Reduzieren Sie das Probenvolumen, das Sie aufgeben 2. Erhöhen Sie die Sorbensmasse 3. Verwenden Sie ein Sorbens mit einer größeren Oberfläche 4. Verwenden Sie ein „stärkeres“ Sorbens 5. Reduzieren Sie während des Beladens die Flussrate (um die „Diffusion“zu verbessern) 6. Reduzieren Sie den Innendurchmesser der Kartusche aber verwenden Sie die gleiche Sorbensmasse (um den Druckabfall zu erhöhen, die Flussrate zu reduzieren und die „Diffusion“ zu verbessern) 7. Verdünnen Sie die Probe in einem „schwächeren“ Lösungsmittel, um die Kapazität zu verbessern |
| D. Die Flussrate ist während des Beladungsschritts zu hoch | 1. Reduzieren Sie während des Beladens die Flussrate 2. Erhöhen Sie die Sorbens-masse 3. Reduzieren Sie den Innendurchmesser der Kartusche, um den Fluss zu reduzieren 4. Verwenden Sie ein Sorbens mit einer größeren Oberfläche |
| E. Das Sorbens ist zu schwach (hat eine geringe Affinität gegenüber dem Analyten im Vergleich zur Probe/Matrix und/oder dem Lösungsmittel, das zur Verdünnung der Probe genutzt wird | 1. Wechseln Sie zu einem stärkeren Sorbens – zu einem mit einer höheren Beladung an Liganden, von einem nicht-endcappten zu einem endcappten Sorbens (oder umgekehrt) 2. Sehen Sie “Lösungen/Vorschläge” für Ursache C („Massenüberladung…“) oben 3. Sehen Sie Lösungen/Vorschläge für Ursache B (Die Probe/Matrix ist in einem „zu starken“ Lösungsmittel gelöst (oder E. Das Sorbens ist zu schwach (hat eine geringe Affinität gegenüber dem Analyten im Vergleich zur Probe/Matrix und/oder dem Lösungsmittel, das zur Verdünnung der Probe genutzt wirdenthält ein „zu starkes“ Lösungsmittel) oben |
| F. Konditionierungs- lösungsmittel wird mit großen Probenvolumina „weggespült“ |
1. Fügen Sie 2 % Methanol oder Isopropanol zur Probe, um ein Kollabieren der Alkylketten (Reversed Phase) beim Beladen zu vermeiden |
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