Suggerimento Tecnico per la Preparazione del Campione
Livello: Intermedio
Risoluzione dei problemi in SPE
Questo suggerimento tecnico esplora alcune delle principali problematiche riscontrate con l'estrazione in fase solida; in particolare con il recupero dell'analita. Il recupero si riferisce alla percentuale di analita trattenuto e recuperato mediante l’introduzione di uno step preparativo (SPE). Alcuni termini, comunemente riferiti al recupero degli analiti sono:
Recupero Relativo: la determinazione indiretta della ritenzione e del recupero di un analita target, alla fine del processo di estrazione, rispetto al recupero di uno standard interno (che è un composto con una struttura simile all'analita target) che viene aggiunto al campione grezzo/matrice prima che questo venga sottoposto alla procedura di estrazione.
Recupero Assoluto: metodo quantitativo per la determinazione della quantità effettiva di analita trattenuto e, successivamente, recuperato al termine del processo di estrazione. Il recupero dell'analita si basa sull’utilizzo di uno standard esterno, aggiunto alla fine del processo di estrazione (piuttosto che di uno standard interno che viene aggiunto e co-estratto con l'analita).
Sintomo
Recupero inferiore al 100%.
Indizio
L’analisi della frazione non trattenuta (volume morto) indica che l'analita è presente nel volume di caricamento.
Problema
L’analita non si lega quantitativamente alla fase stazionaria durante la fase di caricamento del campione.
| Causa | Soluzioni/Suggerimenti |
|---|---|
| A. Il condizionamento della colonna non è stato ottimizzato. | 1. Condizionare la colonna con metanolo o isopropanolo. 2. Utilizzare una quantità sufficiente di metanolo o isopropanolo per bagnare completamente il letto di adsorbente; permettere a più di due volumi di colonna di attraversare lentamente il letto della colonna (si suggerisce l’utilizzo di basso vuoto). 3. Una volta che la colonna è stata condizionata con metanolo o iso-propanolo, far passare in colonna una soluzione acquosa con una composizione simile al campione reale (pH regolato) ma senza l'analita. 4. Non utilizzare volumi troppo alti di "solvente di condizionamento" (punto 3), o permettere che rimanga nella cartuccia SPE per troppo tempo. 5. Non lasciare che la colonna si asciughi durante o dopo il condizionamento (utilizzare un vuoto basso per circa 1 minuto). |
| B. Il campione/matrice è diluito in un solvente con una forza eluente troppo alta. | 1. Diluire il campione in un solvente/soluzione "più debole" per promuovere il legame Nel dettaglio, si consiglia l'utilizzo di un solvente meno polare per la fase normale, più polare per la fase inversa e con una concentrazione salina minore o ad un pH opportunamente ottimizzato per la modalità a scambio Ionico. 2. Diluire il campione con un solvente "debole". 3. Ridurre la quantità del campione caricato. 4. Aumentare la massa del sorbente. 5. Ridurre il flusso durante il caricamento del campione. 6. Utilizzare una fase stazionaria "più ritentiva" con una maggiore affinità per l’analita di interesse. 7. Aggiungere un modificante organico (o regolare il pH) per aumentare l'affinità di legame dell'analita/i con la fase stazionaria. 8. Regolare il pH del campione in modo che l'analita sia neutro per la fase inversa o carico per lo scambio Ionico. 9. Aggiungere il 5-10% di sale (NaCl) per aumentare la polarità del solvente e migliorare la ritenzione degli analiti altamente polari nella in fase Inversa. 10. Aggiungere un reagente di coppia ionica per aumentare il legame degli analiti carichi alla fase stazionaria Inversa. |
| C. Eccessivo carico in massa (la colonna è troppo piccola e/o la massa totale dei soluti/componenti legati è troppo grande). | 1. Ridurre il volume del campione caricato. 2. Aumentare la massa del sorbente SPE. 3. Utilizzare un sorbente con un’area superficiale maggiore. 4. Utilizzare un sorbente "più forte". 5. Ridurre il flusso durante il caricamento (per migliorare la "diffusione" attraverso la fase stazionaria). 6. Ridurre il diametro interno della colonna ma utilizzare la stessa massa di sorbente (per aumentare la caduta di pressione, ridurre il flusso e migliorare la "diffusione"). 7. Diluire il campione in un solvente "più debole" per migliorare la ritenzione con la fase SPE. |
| D. Il flusso è troppo alto durante la fase di caricamento del campione. | 1. Ridurre il flusso durante il caricamento del campione. 2. Aumentare la massa del sorbente. 3. Ridurre il diametro interno della colonna per operare una riduzione del flusso. 4. Utilizzare un sorbente con un’area superficiale maggiore. |
| E. Il sorbente ha una scarsa/bassa affinità per l'analita rispetto al campione/matrice e/o al rispetto al solvente di caricamento. | 1. Passare ad una fase sorbente "più forte", scegliere una fase con una densità di ligando più alta, o passare da un sorbente “non-endcapped” a uno “endcapped” (o viceversa). 2. Vedere "Soluzioni/Suggerimenti" per la Causa C ("Sovraccarico di massa della colonna..."), sopra. 3. Vedere "Soluzioni/Suggerimenti" per la Causa B ("Il campione/matrice è disciolta (o contiene) un solvente che è "troppo forte""), vedi sopra. |
| F. Il solvente di condizionamento viene "lavato via" a causa dell’utilizzo di grandi volumi di campione. | 1. Aggiungere il 2% di metanolo o iso-propanolo al campione per prevenire il collasso della catena alchilica durante la fase di caricamento del campione. |
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