Wskazówki techniczne HPLC / UHPLC
Poziom: Podstawy
Jak pozbyć się ogonowania pików zasadowych analitów w kolumnach z wypełnieniem krzemionkowym typu A w RP
W tej wskazówce technicznej zajmiemy się powszechnym problemem ogonowania pików napotykanym podczas pracy z zasadowymi analitami i krzemionkami "typu A" oraz zaproponujemy dwie strategie jego przezwyciężenia.
Wstęp:
Kolumny starszego typu z fazą odwróconą były oparte na krzemionkach "typu A". Materiały te miały znaczne zanieczyszczenie metalami, co powodowało, że grupy silanolowe na powierzchni krzemionki miały większą i bardziej zmienną aktywność. Producenci w miarę możliwości zabezpieczali materiały po związaniu z odczynnikami C18, próbując zmniejszyć liczbę miejsc, w których może zachodzić wymiana jonowa. Jednak generalnie związki zasadowe miałyby tendencję do ogonowania. Przyjrzyjmy się, jak możemy przezwyciężyć to ograniczenie.
Strategie polepszenia kształtu piku:
• Praca przy niskim pH może pomóc zneutralizować grupy silanolowe na powierzchni krzemionki, zapobiegając wymianie jonów. Bufor fosforanowy 10-20 mM, pH 2,5 jest idealny do tego celu, chociaż należy zachować ostrożność w przypadku stosowania acetonitrylu jako rozpuszczalnika organicznego, aby uniknąć wytrącenia buforu fosforanowego podczas wykonywania gradientu.
• Dodanie konkurencyjnej zasady (lub supresora silanolu) do fazy ruchomej. Zazwyczaj stosuje się dodatki do fazy ruchomej, takie jak TEA (trietyloamina) w stężeniu 5 mM. Chodzi o to, że konkurencyjna zasada wiąże się z anionowymi grupami silanolowymi, zmniejszając ich dostępność do interakcji z analitami. Podejście to, choć skuteczne, generalnie prowadzi do krótkiej żywotności kolumny, ponieważ supresory silanolu mają również tendencję do powodowania szybszej hydrolizy fazy stacjonarnej kolumny i niszczy endcapping, co z kolei odsłania więcej krzemionki, umożliwiając wystąpienie większego ogonowania.
Strategie te pomogą zmniejszyć efekt ogonowania, ale mogą nie usunąć go całkowicie, jak pokazano na poniższych przykładowych chromatogramach (rysunek A i B).
Faza ruchoma: 20 mM bufor fosforanu potasu pH= 2,5 : metanol (70:30)
Szybkość przepływu: 1 mL/min
Detekcja: UV-Vis @254 nm
Faza ruchoma: 20 mM bufor fosforanu potasu pH= 3 z 400uL/L trietyloaminy : acetonitryl (63:37)
Szybkość przepływu: 1 mL/min
Detekcja: UV-Vis @230 nm
Rysunek A pokazuje umiarkowany efekt zastosowania kwaśnego pH w celu złagodzenia ogonowania piku benzyloaminy, podczas gdy rysunek B pokazuje chromaotgram po dodaniu trietyloaminy jako modyfikatora.
Zalecamy stosowanie krzemionki typu B (ultraczystej) do opracowywania nowych metod. W pełni porowate kolumny Luna™ Omega i Kinetex™ Core-Shell zapewniają doskonały kształt piku dla wymagających związków.
Zwiększenie sprawności i zmniejszenie asymetrii piku
Ocena wpływu złączek SecurityLINK™ PEEKsil Fingertight na zwiększenie sprawności i zmniejszenie asymetrii piku na zoptymalizowanym systemie LC.
Webinaria na temat chromatografii na żądanie
Oprócz serii organizowanych przez nas webinariów na temat chromatografii na żywo, możesz również uzyskać dostęp do wszystkich naszych nagranych zasobów. Zapoznaj się z naszą biblioteką webinariów na żądanie i oglądaj je w dogodnym dla siebie czasie.
Znaki towarowe
SecurityLINK, Luna i Kinetex są znakami towarowymi firmy Phenomenex.
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
CONNECT WITH US
