Suggerimento tecnico HPLC/UHPLC
Livello: Base
Come ridurre il tailing (in RP) degli analiti basici su fasi stazionarie a base di silice di tipo A
In questo suggerimento tecnico, affronteremo il problema del tailing degli analiti basici, presente quando si lavora con analiti basici e silice di "tipo A" e offriremo due strategie per superarlo.
Introduzione:
Le prime colonne a fase inversa sono state sviluppate con silice di "tipo A"; questo materiale presenta una sostanziale contaminazione da metalli, che attiva i silanoli sulla superficie rendendo le interazioni secondarie più forti e variabili. Nel tentativo di ridurre il numero di siti in cui esse avvengono, i produttori hanno inertizzato la silice tramite un processo di endcapping, successivo alla fase di derivatizzazione con catene C18. Tuttavia, i composti basici potrebbero ancora dar vita a scodamento indesiderato. Vediamo alcuni approcci per ridurre questo effetto.
Strategie per migliorare la forma del picco:
• Lavorare a pH basso, questo approccio neutralizza i silanoli sulla superficie della silice, prevenendo le interazioni di tipo scambio ionico. Un tampone fosfato 10-20 mM pH 2.5 è l’ideale per questo scopo, anche se è necessario prestare attenzione quando si lavora in gradiente di acetonitrile per evitare la precipitazione del sale.
• Aggiungere una base alla fase mobile, come TEA (trietil ammina) 5mM . La base schermerà i silanoli riducendo la loro disponibilità a stabilire interazioni ioniche con gli analiti. Questo approccio, sebbene sia particolarmente efficace, genera spesso una breve durata della colonna; i soppressori tipo TEA tendono a causare una più rapida idrolisi della fase stazionaria e dell’endcapping, esponendo maggiori silanoli e quindi aumentando la possibilità che si verifichi scodamento.
Come dimostrato nei cromatogrammi di esempio (Figure A e B), le strategie riportate aiutano a ridurre il tailing ma non lo eliminano completamente.
Fase mobile: tampone di fosfato di potassio 20 mM pH= 2,5 : Metanolo (70:30)
Velocità di flusso: 1 mL/min
Detector: UV-Vis @254 nm
Fase mobile: tampone di fosfato di potassio 20 mM pH= 3 +00uL/L Trietilamine: ACN (63:37)
Velocità di flusso: 1 mL/min
Detector: UV-Vis @230 nm
La Figura A mostra l'effetto dell'uso di un pH acido per mitigare il tailing della benzilammina, mentre la Figura B mostra il profilo cromatogragico ottenuto dopo l'aggiunta di trietilammina come modificatore.
Raccomandiamo l'uso di silice di tipo B (ultra-pura) nello sviluppo di nuovi metodi. Le colonne Luna™ Omega completamente porose e Kinetex™ Core-Shell generano una forma di picco simmetrica anche per composti particolarmente attivi.
Aumentare l'efficienza e ridurre l'asimmetria di picco
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