Astuce technique HPLC/UHPLC
Niveau : débutant
Limiter la trainée de pic des analytes basiques avec les phases stationnaires en silice de type A en chromatographie en phase inverse (RP)
Dans cette astuce technique, nous aborderons le problème courant de la traineée de pic rencontré lors de l'analyse d'analytes basiques avec des silices de "type A" et proposerons deux stratégies pour y remédier.
Introduction :
Les premières colonnes de phase inverse contenaient des silices de "type A". Ces matériaux étaient fortement contaminés par des métaux. Les groupes silanol à la surface de la silice avaient ainsi une activité plus importante et plus variable. Les fabricants ont alors procédé à l'end-capping des matériaux après greffage du ligand C18 sur la phase stationnaire, afin de réduire le nombre de sites où l'échange d'ions pouvait avoir lieu. Cependant, on observe le phénomène de trainée des pics pour les composés basiques.
Parmi les approches adoptées par les chromatographistes pour réduire ce phénomène, nous pouvons citer :
• Travailler à pH acide : cette approche vise à neutraliser les groupes silanols à la surface de la silice, empêchant ainsi l'échange d'ions. Un tampon de phosphate 10-20 mM, pH 2,5 est idéal, bien qu'il faille faire attention si l'on utilise de l'acétonitrile comme solvant organique pouvant causer une précipitation du phosphate en cas de gradient.
• Ajouter une base concurrente (ou suppresseur de silanol) à la phase mobile : on utilise généralement des réactifs comme la TEA (triéthylamine) à une concentration de 5 mM. L'idée ici est que la base concurrente s'associe aux groupes silanols, réduisant leur disponibilité d'intéraction avec les analytes. Même si cette approche fonctione, elle conduit généralement à une courte durée de vie de la colonne car les suppresseurs de silanols ont également tendance à provoquer une hydrolyse plus rapide de la phase stationnaire et de l'end-capping. Cette dégradation favorise plus de silice active et donc plus de trainées de pics.
Ces stratégies aideront à diminuer l'effet de traînée mais peuvent ne pas l'éliminer complètement, comme le démontrent les chromatogrammes d'exemple ci-dessous (Figure A et B).
Phase mobile : Tampon phosphate de potassium 20 mM pH= 2,5 : Méthanol (70:30)
Débit : 1 ml/min
Détection : UV-Vis à 254 nm
Phase mobile : Tampon phosphate de potassium 20 mM pH = 3 avec 400 µl/l de triéthylamine : acétonitrile (63:37)
Débit : 1 ml/min
Détection : UV-Vis à 230 nm
La figure A montre l'effet modéré de l'utilisation d'un pH acide pour atténuer l'étalement de la benzylamine, tandis que la figure B montre la chromatographie résultante après l'ajout de triéthylamine comme modificateur.
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