HPLC/UHPLC Technischer Tipp
Niveau: Grundlagen
Vermeidung von Peaktailing von basischen Analyten auf Typ A Silikagelen bei der RP-Chromatographie
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In diesem technischen Tipp werden wir das häufige Problem des Peaktailing ansprechen, das beim Arbeiten mit basischen Analyten und "Typ A" Kieselgelen auftritt, und zwei Strategien zur Überwindung dieses Problems vorstellen.
Einführung:
Umkehrphasen-Säulen älterer Generation basieren auf "Typ A"-Kieselgelen. Diese Materialien wiesen eine beträchtliche Metallverunreinigung auf, wodurch die Silanolgruppen auf der Oberfläche des Siliciumdioxids eine größere und variablere Aktivität aufwiesen. Nach der Anbindung der C18-Liganden endcappen Hersteller die Materialien so weit wie möglich, um die Anzahl der aktiven Stellen zu reduzieren, an denen Ionenaustausch-Wechselwirkungen stattfinden können. Allerdings würden basische Verbindungen im Allgemeinen ein schlechte Peakform mit Tailing aufweisen. Einige Ansätze, die von Chromatographie-Anwendern eingesetzt werden, um dieses Problems zu reduzieren, sind:
Strategien zur Verbesserung der Peakform:
• Arbeiten bei niedrigem pH-Wert: Dieser Ansatz zielt darauf ab, die Silanolgruppen auf der Kieselgeloberfläche zu neutralisieren, wodurch Ionenaustausch Wechselwirkungen verhindert werden. Ein 10-20 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 2,5 ist für diesen Zweck ideal. Bei der Verwendung von Acetonitril als organischem Lösungsmittel ist jedoch darauf zu achten, dass das Ausfallen des Phosphatpuffers bei der Durchführung eines Gradienten vermieden wird.
• Hinzufügen einer konkurrierenden Base (oder eines Silanol-Suppressors) zur mobilen Phase: Typischerweise werden Reagentien wie TEA (Triethylamin) in einer Konzentration von 5 mM verwendet. Die Idee hierbei ist, dass sich die konkurrierende Base mit den Silanolgruppen des Kieselgels assoziiert, wodurch deren Verfügbarkeit zur Interaktion mit den Analyten verringert wird. Dieser Ansatz ist zwar erfolgreich, führt jedoch im Allgemeinen zu einer kurzen Säulenlebensdauer, da die Silanol-Suppressoren auch dazu neigen, eine schnellere Hydrolyse der stationären Phase und des Endcappings zu bewirken. Dies wiederum setzt noch mehr Silanole frei, wodurch mehr Tailing auftreten kann.
Diese Strategien tragen dazu bei, den Tailing-Effekt zu vermindern, können ihn aber nicht vollständig beseitigen, wie die folgenden Beispielchromatogramme zeigen (Abbildung A und B).
Mobilen Phase: 20 mM Kaliumphosphat-Puffer pH= 2.5 : Methanol (70:30)
Flussrate: 1 ml/min
Detektion: UV-Vis @254 nm
Mobilen Phase: 20 mM Kalumphosphat-Puffer pH= 3 with 400ul/l Triethylamine : Acetonitrile (63:37)
Flussrate: 1 ml/min
Detektion: UV-Vis @230 nm
Abbildung A zeigt den moderaten Effekt der Verwendung eines sauren pH-Werts zur Minderung des Tailings bei Benzylamin, während Abbildung B die resultierende Chromatographie nach Zugabe von Triethylamin als Modifikator darstellt.
Erhöhung der Peak-Effizienz und Reduzierung der Peak-Asymmetrie:
Bewertung des Einflusses des SecurityLINK™ PEEKsil Fingertight Fitting Systems auf die gesteigerte Peak-Effizienz und die Reduzierung der Peak-Asymmetrie bei optimierter Instrumentierung.
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