Suggerimento Tecnico per la Preparazione del Campione
Livello: Intermedio
Buone pratiche per la preparazione del campione per "Peptide Mapping"
Nel mondo dei bioterapici e dei biosimilari, le agenzie di regolamentazione impongono requisiti di caratterizzazione focalizzati principalmente sulle proprietà fisico-chimiche del farmaco che influenzano l'efficacia, la sicurezza e l'immunogenicità. La cromatografia svolge un ruolo importante nell’analisi delle proprietà fisico-chimiche, come lo studio delle strutture primaria, terziaria e quaternaria e le modifiche post-traduzionali. Una tecnica chiave per studiare la struttura primaria è il Peptide Mapping, tramite la digestione enzimatica, seguita da analisi LC. La proteasi più utilizzata per la digestione proteolitica è la tripsina; nello step di digestione possono essere applicati diversi protocolli per migliorare l’efficacia di taglio, che saranno discussi qui di seguito.
La maggior parte delle digestioni proteiche viene effettuata utilizzando la tripsina per la sua ben nota specificità di taglio. La tripsina idrolizzerà solo i legami peptidici al carbossi terminale di arginina (Arg) o di lisina (Lys) con le seguenti importanti eccezioni: il taglio non avviene quando Lys e Arg sono N-Linked ad amminoacidi carichi negativamente, o se prolina (Pro) è legata al C terminale di Lys o Arg.
La tripsina è largamente usata perché i peptidi prodotti hanno residui basici sul C-Terminale, quindi più facili da ionizzare in spettrometria di massa, prinicipale tecnica utilizzata nel "peptide mapping". Uno dei vantaggi principali del taglio con tripsina è l'intervallo di massa dei peptidi risultanti, che è tipicamente tra 600 e 4000 Da, dimensioni ideali per le successive analisi LC / UV o LC MS / MS.
La digestione triptica prevede una serie di passaggi qui riassunti:
Denaturazione e riduzione: Un agente caotropico, in genere urea o guanidina, è necessario per favorire la denaturazione della proteina con conseguente esposizione dei siti di taglio per la tripsina. L'urea è tendenzialmente evitata perché tende a ridurre la copertura di sequenza favorendo la rottura e la carbamilazione di residui di lisina e cisteina. Il reagente più usato per lo step di denaturazione è la guanidina cloruro (GnHCl). A denaturazione avvenuta, questo caotropo deve essere rimosso in quanto può ininbire l'attività di alcune proteasi.
Alchilazione: Esistono due agenti alchilanti comunemente utilizzati: Iodoacetamide (IAM) e l'acido Iodoacetico (IAA). Tra questi la IAM è il più comune, nonostante dia reazioni di alchilazione meno specifiche dell'IAA, in quanto reagisce rapidamente. Con entrambi i reagenti l'aggiunta di ditiotreitolo (DTT) aiuterà a prevenire le alchilazioni non specifiche.
Desalificazione: Dopo lo step di riduzione/alchilazione, è fondamentale rimuovere i reagenti in eccesso prima della digestione enzimatica. Sono comunemente utilizzati tre approcci principali: dialisi, filtrazione (in centrifuga) con taglio molecolare o colonne di desalting. Lo svantaggio principale della dialisi sono i lunghi tempi richiesti per lo scambio di tampone (ore), anche se la perdita di campione è minima. I filtri da centrifuga e le colonne di desalting causano una perdita di materiale proteico maggiore, ma sono molto più rapide rispetto alla dialisi.
Digestione: I peptidi triptici ottenuti con tripsina possono essere relativamente corti. La tripsina è la proteasi più comunemente usata per lo step di digestione. Questo enzima ha una preferenza di taglio per residui di Arg e un'efficienza di taglio inferiore per residui di Lys. Siti di missed cleavage sono rappresentati da residui di Asp o Glu accanto a Lys o Arg sul C-terminale e da residui di Prolina (Pro) sull' N terminale. Per aumentare il numero di proteine identificate e aumentare la copertura di sequenza è comune utilizzare anche proteasi ortogonali tra cui AspN o GluC.
Quando la copertura della sequenza è critica, è possibile utilizzare proteasi ortogonali che sono riassunte di seguito.
| Enzima | Sito di taglio | Vantaggio | Limitazioni |
|---|---|---|---|
| ArgC | C-terminale di R | Incremento di copertura del proteoma | Frammenti peptidici più grandi della tripsina |
| AspN | N-terminale di D | Ampio range di pH | Frammenti peptidici più grandi della tripsina. Missed-Cleavage possibili |
| Chimotripsina | C-terminale fi F, Y, L, W | Proteoma ortogonale alla tripsina | Pepdidi idrofobici risultanti ma missed-Cleavage |
| GluC | C-terminale di D | Incremento di copertura del proteoma | Frammenti peptidici più grandi della tripsina |
| LysC | C-terminale di K | Complementari alla tripsina | Si sovrappone alla tripsina, quindi non una grande proteasi ortogonale |
| Pepsina | C-terminale di Y F W | Alta attività a basso pH per HDX-MS | Estremamente aspecifica |
Di seguito è riportato un elenco riassuntivo dei parametri più stringenti da considerare nei protocolli di digestione con tripsina.
| Parametro | Intervallo | Esempio | Considerazioni |
|---|---|---|---|
| Rapporto Enzima/substrato | 1:5 – 1:50 | 1:20 | Ottimizza la lunghezza e la temperatura della digestione |
| Temperatura (°C) | 37-90 | 56 | Workflow - Deamidazione a 37 ° C |
| Durata della digestione (ore) | 2-16 | 4 | Mancata digestione per autoprotolisi della tripsina |
| pH | 7.5-8.2 | 7.6 | Deamidazione a pH > 7,5 Attività ottimale della tripsina |
| Aggiunta di proteasi | n/a | LysC | Step finali della digestione |
In conclusione, l'elevata copertura di sequenza dipende non soltanto dal metodo analitico o dal'analisi LC o LC/MS ma da tutti gli step e le precauzioni prese nella fase di preparazione del campione. Gli step discussi in questo suggerimento svolgono un ruolo importante nel favorire la maggiore copertura di sequenza possibile. Ottimizzato il protocollo di digestione della proteina, l'analisi successiva tramite HPLC o LCMS diventa un processo molto più semplice per garantire una copertura adeguata.
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