HPLC/UHPLC Technischer Tipp
Niveau: Grundlagen
Die Wirkung des End-Cappings
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Das zum Packen von HPLC-Säulen verwendete Siliciumdioxid ist ein Polymer aus Silicium und Sauerstoff mit Si-OH-Gruppen (Silanolen) an der Oberfläche. An diese Silanole werden funktionelle Gruppen mit Hilfe eines Silanreagens gebunden, um das Basismaterial zu funktionalisieren.
Wenn HPLC-Säulen funktionalisiert werden, ist es unmöglich, eine 100%ige Phasenbelegung zu gewährleisten und alle verfügbaren Silanolgruppen (freie Hydroxylgruppen auf der Oberfläche der Kieselsäure) mit dem funktionellen Liganden reagieren zu lassen. Mit der Anbindung der ersten funktionellen Liganden steigt die sterische Hinderung aller weiteren Bindungsreaktionen und das Anbringen der nachfolgenden funktionellen Liganden wird dadurch erschwert.
Ohne End-Capping würden in der Säule eine beträchtliche Anzahl an zugänglichen, hochaktiven Restsilanolen übrigbleiben, die das Potential haben, die Selektivität der stationären Phase zu verändern. Diese Restsilanolgruppen können starke ionische und polare Wechselwirkungen mit polaren und basischen Gruppen der Analyten ausbilden. Daher ist es unerlässlich, die Anzahl der freien Silanole nach der Bindung der stationären Phase durch End-Capping zu reduzieren.
In der Vergangenheit wurde das End-Capping mit einer kleinen hydrophoben Gruppe, dem Trimethylsilan, durchgeführt. In den letzten Jahren haben mehrere Hersteller auch andere Gruppen eingesetzt, um die Selektivität der Säule und speziell ihre polaren Eigenschaften zu ändern.
TMS end-capping
Wenn das für das End-Capping verwendete Reagenz z.B. geladene funktionelle Gruppen enthält, verleiht dies der Oberfläche eine Ionenaustauschfunktionalität. Die Säule wird somit neben den Umkehrphase-Wechselwirkungen der C18-Phase auch Ionenaustauscheigenschaften aufweisen.
Entsprechend verleiht eine polare funktionelle Gruppe der Oberfläche polare Eigenschaften.
| Art der stationären Phase | End-capping | Vorteile |
|---|---|---|
| C18 | Trimethylsilyl-Gruppe | |
| PS-C18 | Positiv geladene Gruppe und Trimethylsilylgruppe | |
| Polar C18 | Polare Gruppe und Trimethylsilylgruppe | |
| XB-C18 | Di-isobutyl-Seitenketten und Trimethylsilyl-Gruppe |
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass neue End-Capping-Technologien die Analyse von Verbindungen, die früher als schwierig galten, erheblich verbessern können. So lassen sich beispielsweise mit PS-C18-Säulen für die Analyse von Basismedikamenten heute eine hervorragende Peakform und kürzere Laufzeiten erzielen. Es hat sich gezeigt, dass die Polar-C18-Chemie Verbindungen wie Metaboliten am besten zurückhält, und die XB-C18-Chemie hat sich als ausgezeichnete Chromatographiemedium für die Peptidanalyse erwiesen, mit verbesserter Retention kleiner polarer Peptide.
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