Wskazówki techniczne HPLC / UHPLC
Poziom: Podstawowy
Znaczenie dobrze przygotowanej fazy ruchomej
Bufor to roztwór wodny zawierający słaby kwas i sprzężoną z nim zasadę (lub słabą zasadę i sprzężony z nią kwas). pH roztworu buforowego zmienia się w bardzo niewielkim stopniu po dodaniu do niego niewielkiej ilości mocnego kwasu lub zasady. To może pozwolić na zachowanie stanu równowagi przy zmiennych czynnikach środowiskowych. Roztwory buforowe są stosowane do utrzymania pH na prawie stałym poziomie. Są one odporne na zmiany pH ze względu na obecność równowagi pomiędzy słabym kwasem (HA) i jego sprzężoną zasadą (B).
HA ⇌H^++A^-
(kwas) ⇌ (jon wodorowy) + (sprzężona zasada)
Jak działa bufor?
Gdy do mieszaniny równowagowej słabego kwasu i jego sprzężonej zasady dodamy trochę mocnego kwasu (więcej H+), równowaga przesuwa się w lewo, zgodnie z zasadą Le Chateliera. Podobnie, jeśli do mieszaniny dodamy silną zasadę, stężenie jonów wodorowych zmniejszy się mniej niż przewidywano.
Podczas przygotowywania buforu istnieje kilka ogólnych wytycznych, których należy przestrzegać:
- Kalibracja pH-metru - najlepiej przy wartościach pH powyżej i poniżej docelowej dla roztworu.
- Istnieją dostępne na rynku roztwory kalibracyjne dedykowane to tego celu
- Odważyć sól buforową, aby uzyskać pożądane stężenie buforu
- Do kolby miarowej zawierającej wodę o czystości do HPLC dodać odważoną sól i dokładnie wymieszać do rozpuszczenia
- Używając sondy pH i pH-metru, zmierzyć pH roztworu
- Doprowadzić pH do pożądanej wartości przez dodanie niewielkich objętości mocnego kwasu i/lub mocnej zasady
- Gdy pH jest prawidłowe, rozcieńczyć roztwór do ostatecznej żądanej objętości i dobrze wymieszać
W HPLC, bufory są zwykle używane do kontrolowania wtórnych interakcji, które są ogólnie uważane za "niepożądane" w świecie chromatograficznym. Są one również używane do kontroli stanu jonizacji analitu, aby zapewnić, że nie jest on obecny w więcej niż jednym stanie zjonizowanym. Wartość pKa określa pH, w który istnieją dwie formy analitu - w 50% forma zjonizowana i w 50% forma obojętna. Jeśli pracujesz przy tym pH, zobaczysz rozszczepione piki i zmienne czasy retencji. Warto opracować metody, w których pH fazy ruchomej jest o 2 jednostki różne od pKa docelowego analitu.
Fig 1.
Fig. 2
Przygotowując izokratyczne fazy ruchome należy wziąć pod uwagę kilka dodatkowych kwestii, aby zapewnić stabilność metody
- Jeśli to możliwe, wstępnie wymieszaj fazę ruchomą, co wyeliminuje błąd pompy.
- Zawsze stosuj tę samą metodę przygotowania: na przykład, jeśli najpierw dodajesz wodę, powinieneś zawsze dodawać ją jako pierwszą. Jeśli odmierzasz poszczególne składniki, a następnie mieszasz, powinieneś zawsze robić to w ten sposób. Nie należy zmieniać tego procesu, ponieważ wyniki mogą się znacznie różnić pod względem czasu retencji analitu.
Poniżej znajduje się eksperyment, który pokazuje tę zmienność, gdy fazy ruchome zostały zmieszane w następujący sposób:
- Najpierw woda: 400 mL wody w cylindrze miarowym, dodaj do 1-litrowej kolby miarowej, rozcieńcz do kreski MeOH
- MeOH najpierw: 600 mL MeOH w cylindrze miarowym, dodaj do 1-litrowej kolby miarowej, rozcieńczyć wodą do kreski
- MeOH i woda mierzone pojedynczo: 600 mL MeOH w cylindrze miarowym, przenieś do zbiornika fazy ruchomej; 400 mL wody w tym samym cylindrze miarowym i przenieś do zbiornika fazy ruchomej
- Pozwól, aby pompa wymieszała A = wodę z B = MeOH
Fig. 3
Kinetex® 5μm XB-C18 150 x 4,6 mm; 60:40 MeOH: H20
Prędkość przepływu 1.25mL/min
Objętość nastrzyku 2µL
Stężenia buforów są również ważne. Ogólnie uważa się, że stężenia poniżej 10mM nie zapewniają zdolności buforowania, wymaganej do kontrolowania aktywności silanolowej lub stanu jonizacji związku. 10mM byłoby uważane za minimalne skuteczne stężenie dla fazy odwróconej i HILIC. Dla innych technik, takich jak SEC, wymagane są znacznie wyższe stężenia i nierzadko obserwuje się stężenia przekraczające 100mM dla tych metod. Stężenie buforu jest czymś, co musi być starannie zbilansowane, aby zapewnić rozpuszczalność w każdych warunkach. Podczas pracy w warunkach odwróconej fazy, może być konieczne ograniczenie stężenia buforu, z którym pracujesz, jeśli metoda zawiera wysokie poziomy fazy organicznej (na przykład przy gradiencie), aby uniknąć wytrącania buforu.
Faza ruchoma ma tak samo duży wpływ na selektywność, jak faza stacjonarna, a staranność wyboru i przygotowania jest równie ważna, jak testowanie różnych partii faz stacjonarnych przy opracowywaniu stabilnych metod HPLC.
Headquarters
411 Madrid Avenue, Torrance, CA 90501
t: (310) 212-0555 f: (310) 328-7768
Stay up to date on the latest from Phenomenex
Site Map Terms and Conditions of Sale Privacy Statement Quality Policy Site Terms of Use Trademarks California Supply Chains Act Impressum © 2024 Phenomenex Inc. All rights reserved.