Technický tip pro HPLC / UHPLC
Úroveň: Základní
Význam správně připravené mobilní fáze
Tipy v jiných jazycích
Pufr je VODNÍ roztok obsahující slabou kyselinu a její konjugovanou bázi (nebo slabou bázi a její konjugovanou kyselinu). Po přidání malého množství silné kyseliny nebo zásady se pH pufrovacího roztoku mění velmi málo a může tak pomoci zamezit změnám podmínek v analytické metodě při malých odchylkách faktorů prostředí. Pufrovací roztoky se používají k udržení pH na téměř konstantní hodnotě. Jsou odolné vůči změně pH v důsledku přítomnosti rovnováhy mezi touto slabou kyselinou (HA) a její konjugovanou bází (B).
HA ⇌H^++A^-
(kyselina) ⇌ (vodíkový ion) + (konjugovaná báze)
Jak fungují pufry
Když se do rovnovážné směsi slabé kyseliny a její konjugované báze přidá nějaká silná kyselina (více H+), rovnováha se posune doleva v souladu s Le Chatelierovým principem. Podobně, pokud je do směsi přidána silná báze, koncentrace vodíkových iontů klesá o méně než množství očekávané pro množství přidané báze.
Při přípravě pufrů existuje několik obecných pokynů, které byste měli dodržovat:
- Kalibrujte pH metr; ideálně při hodnotách pH nad a pod cílovou hodnotou pro přípravu pufru.
- K tomuto účelu se prodávají kalibrační pufrovací roztoky.
- Odvažte sůl pufru, abyste dosáhli požadované koncentrace pufru.
- Přidejte ji do odměrné baňky obsahující vodu v čistotě pro HPLC a důkladně promíchejte, aby se rozpustila.
- Pomocí pH sondy a pH metru změřte pH roztoku.
- Upravte pH na požadovanou hodnotu přidáním malého objemu silné kyseliny a/nebo silné báze.
- Jakmile je pH správné, zřeďte roztok na konečný požadovaný objem a dobře promíchejte.
V HPLC se pufry obvykle používají k ovlivnění sekundárních interakcí, které jsou v chromatografii obecně považovány za „nežádoucí“. Používají se také k řízení ionizačního stavu analytu, aby se zajistilo, že není přítomen ve více než jednom ionizovaném stavu. pKa sloučeniny představuje pH, při kterém je z 50% ionizovaná a z 50% neutrální. Pokud pracujete při tomto pH, uvidíte rozdělené píky (split peaks) a proměntlivé retenční časy. Všechny metody by měly být alespoň dvě jednotky pH od pKa cílového analytu.
Fig 1.
Fig. 2
Při přípravě izokratických mobilních fází je několik dalších hledisek k zajištění dostatečné robustnosti metody.
- Pokud je to možné, předem promíchejte svou mobilní fázi, čímž se eliminuje chyba pumpy.
- Pro přípravu používejte vždy stejnou metodu; například pokud nejprve přidáte vodu, měli byste ji vždy přidat jako první. Pokud jednotlivé komponenty změříte a poté promícháte, měli byste to dělat vždy tímto způsobem. Tento proces neměňte, protože výsledky se mohou významně lišit, pokud jde o retenční čas analytu.
Níže je experiment, který ukazuje tuto variabilitu, když byly mobilní fáze smíchány následujícími způsoby.
- Nejprve voda: 400 ml vody v odměrném válci, přidejte do 1 litrové odměrné baňky, zřeďte po značku MeOH
- Nejprve MeOH: 600 ml MeOH v odměrném válci, přidejte do odměrné baňky o objemu 1 litr, zřeďte po značku vodou
- MeOH a voda měřeny jednotlivě: 600 ml MeOH v odměrném válci, přenos do zásobníku mobilní fáze; 400 ml vody ve stejném odměrném válci a převedeno do zásobníku mobilní fáze
- Nechte čerpadlo smíchat A = vodu s B = MeOH
Fig. 3
Kinetex™ 5μm XB-C18 150 x 4.6mm; 60:40 MeOH: H20
Průtok 1.25mL/min
Objem nástřiku 2µL
Koncentrace pufru jsou také důležité, obecně se má za to, že koncentrace pod 10 mM nenabízejí pufrovací kapacitu potřebnou k ovlivnění aktivity silanolu, nebo ionizačního stavu sloučeniny. Koncentrace 10 mM je považována za minimální efektivní koncentraci pro reverzní fázi a HILIC. U jiných technik, jako je size exlucion, jsou vyžadovány výrazně vyšší koncentrace a u těchto metod nejsou neobvyklé koncentrace vyšší než 100 mM. Koncentrace pufru je něco, co musí být pečlivě vyváženo, aby byla zajištěna rozpustnost za všech podmínek. Pokud pracujete s reverzní fází, možná budete muset omezit koncentraci pufru, se kterým pracujete, pokud metoda obsahuje vysoké hladiny organických látek (například přes gradient), aby se předešlo vysrážení pufru.
Mobilní fáze přispívá k selektivitě stejně jako Vaše stacionární fáze. Její správný výběr a příprava je stejně důležitá jako testování šarží stacionárních fází při vývoji robustních HPLC metod.
Headquarters
411 Madrid Avenue, Torrance, CA 90501
t: (310) 212-0555 f: (310) 328-7768
Stay up to date on the latest from Phenomenex
Site Map Terms and Conditions of Sale Privacy Statement Quality Policy Site Terms of Use Trademarks California Supply Chains Act Impressum © 2024 Phenomenex Inc. All rights reserved.