Suggerimento tecnico HPLC/UHPLC
Livello: Intermedio
Come impatta il fattore di capacità sulla robustezza?
L’analisi dei dati HPLC porta naturalmente a concentrarsi sul tempo di ritenzione, sull'asimmetria di picco e sull'efficienza. Questi parametri permettono all'analista di identificare e quantificare gli analiti con un’accuratezza che sarà tanto maggiore quanto più accurati sono le misurazioni effettuate.
Il fattore di capacità è spesso un parametro trascurato, ma se utilizzato correttamente può guidare l'analista verso metodi robusti. Il fattore di capacità serve a normalizzare il tempo di ritenzione di un analita alle dimensioni della colonna analitica ed è definito come:
K’ = tr - t0/t0
dove tr è il tempo di ritenzione dell'analita e t0 il tempo di eluizione di un composto non trattenuto dalla colonna. L'importanza del fattore di capacità può essere illustrata ancor meglio da un esempio:
1. Acido Ossalico
2. Acido Tartarico
3. Acido Glicolico
4. Acido Formico
5. Acido Piruvico
6. Acido Malonico
7. Acido Acetico
8. Acido Maleico
9. Acido Citrico
Qui riportiamo la separazione degli acidi organici su una colonna C18 stabile al 100% di acquoso. La fase mobile utilizzata è 20 mM tampone fosfato a pH 2,9, mentre il flusso è impostato a 0,7 ml/min. L'acido ossalico sembra avere una buona ritenzione (tr pari a 4 minuti), ma facendo attenzione si nota che il t0 della colonna utilizzata è di circa 3,7 minuti. Tenuto conto di questo, possiamo affermare che l’acido ossalico, un di-acido molto polare, viene scarsamente trattenuto dalla colonna.
K’ = 3,9 - 3,7/3,7 = 0,054
La scarsa ritenzione è indice che l'acido ossalico non riesce a stabilire interazioni con la fase stazionaria nel passaggio attraverso la colonna. In questi casi la ritenzione dell’analita sarà fortemente influenzata da piccole modifiche in alcuni parametri, tra cui:
• Composizione della fase mobile
• pH della fase mobile
• Forza del diluente
• Temperatura
È probabile che un metodo con queste caratteristiche mostri una ritenzione dell’acido ossalico variabile da corsa a corsa, colonna a colonna e da un lotto a lotto.
Quanto detto porta a raccomandare di sviluppare metodi con fattori di capacità all'interno dell’intervallo 2-10. Abbiamo visto i potenziali problemi legati ad un fattore di capacità inferiore a 2. Perché fermarsi a un fattore di capacità di 10?
Durante una corsa cromatografica in isocratica, la larghezza del picco, a causa di fenomeni diffusivi, aumenta all'aumentare del tempo di ritenzione. L'uso di colonne altamente efficienti, contribuisce a ridurre la diffusione ma non può essere eliminato. Fattori di capacità alti si traducono in tempi di ritenzione lunghi e corse cromatografiche troppo lunghe con una riduzione della produttività del laboratorio.
1. Idrocortisone
2. Corticosterone
3. 11-a-Hydroxyprogesterone
4. Acetato di Cortisone
5. 11-Ketoprogesterone
Qui riportiamo un esempio di steroidi separati su una colonna 150 x 4,6 mm a 1 ml / min (in isocratica). E’ evidente la riduzione dell’efficienza dell’ultimo picco, chiaro segno che l'ultimo picco ad essere eluito viene mantenuto in colonna per un periodo di tempo eccessivo.
E’ sempre utile far riferimento alle linea guida che riportano a fattori di capacità compresi tra 2 e 10, ma rimane l'interrogativo su come possono essere regolati.
Il fattore di capacità è inversamente proporzionale alla forza eluente della fase mobile. Una maggiore forza eluente produce fattori di capacità bassi e viceversa. Quando è impossibile aumentare i fattori di capacità bassa riducendo la forza eluente della fase mobile, potrebbe essere necessario passare a una fase stazionaria in grado di offrire una maggiore ritenzione degli analiti, ad esempio utilizzando una fase stazionaria più polare per analiti polari.
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