Astuce technique HPLC/UHPLC
Niveau : Intermédiaire
Comment le facteur de capacité favorise-t-il le développement de méthodes plus fiables ?
Lorsque l'on examine les données générées lors d’une analyse HPLC, il est naturel de se concentrer sur le temps de rétention, l'asymétrie des pics et l'efficacité. Ces paramètres permettent à l'utilisateur d'identifier et de quantifier les analytes. Plus ces informations seront précises, plus la confiance dans l'identité du pic et dans la concentration de l'analyte sera grande.
Le facteur de capacité est souvent un paramètre négligé, mais lorsqu'il est utilisé correctement, il peut aider l'utilisateur à élaborer une méthodologie plus robuste. Le facteur de capacité, qui sert à normaliser le temps de rétention d'un analyte par rapport aux dimensions de la colonne analytique, est défini comme suit :
K’ = tr - t0/t0
Où tr st le temps de rétention de l'analyte, et t0 le temps d'élution d'un composé non retenu.
L'importance du facteur de capacité peut être illustrée au mieux par un exemple :
1. Acide oxalique
2. Acide tartrique
3. Acide glycolique
4. Acide formique
5. Acide pyruvique
6. Acide malonique
7. Acide acétique
8. Acide maléique
9. Acide citrique
Nous avons ici une séparation d'acides organiques, réalisée sur une colonne C18, stable en conditions 100% aqueuses. La phase mobile est un tampon phosphate de potassium 20 mM à pH 2,9, avec un débit de 0,7 ml/min. A première vue, l'acide oxalique est retenu à presque 4 minutes, mais en regardant de plus près, le t0 de cette colonne est d'environ 3,7 minutes. Lorsque l'on considère ces résultats, il est clair que l'acide oxalique, un diacide très polaire, est à peine retenu par la colonne.
K’ = 3.9 - 3.7/3.7 = 0.054
Cela indique que l'acide oxalique ne passe pratiquement aucun temps à élaborer des interactions avec la phase stationnaire pendant son transit dans la colonne. Dans ce cas, la rétention de l'analyte sera grandement influencée par de petites modifications involontaires des paramètres, tels que :
• La composition de la phase mobile
• Le pH de la phase mobile
• La force du diluant de l'échantillon
• La température
Il est donc peu probable qu'une telle méthode soit robuste, la rétention de l'acide oxalique variant d'une analyse à l'autre, d'une colonne à l'autre et d'un lot de phase mobile à l'autre.
C’est pourquoi il est recommandé, lors du développement de méthodes, que les facteurs de capacité se situent dans une gamme de 2 à 10. Nous avons vu les problèmes que peuvent poser les facteurs de capacité inférieurs à 2, mais pourquoi s'arrêter à un facteur de capacité de 10 ?
Avec une méthode isocratique, la largeur du pic augmente avec le temps de rétention en raison de la diffusion. Si l'utilisation de colonnes ayant des particules plus petites et de débits optimaux permet de réduire cette diffusion, elle ne peut être éliminée. En outre, des facteurs de capacité élevés se traduisent en fin de compte par des temps d’analyse longs, ce qui n'est généralement pas souhaitable pour la productivité du laboratoire.
1. Hydrocortisone
2. Corticostérone
3. 11-a-Hydroxyprogestérone
4. Acétate de cortisone
5. 11-Kétoprogestérone
Nous avons ici un exemple de stéroïdes analysés en utilisant une colonne de dimension 150 x 4,6 mm à 1 ml/min. La 11-etoprogesterone élue à environ 17,5 min, avec un facteur de capacité d'environ 10,6. L'élargissement des pics est évident dans ce passage isocratique, ce qui indique que le dernier pic d'élution est retenu trop longtemps sur la colonne.
Comprendre où doit se situer le facteur de capacité (entre 2 et 10) est utile, mais reste la question suivante : comment ajuster les facteurs de capacité ?
Le facteur de capacité est inversement proportionnel à la force élutropique de la phase mobile. Une force élutropique plus élevée diminue le facteur de capacité, et vice versa. Lorsqu'il n'est pas possible d'augmenter les faibles valeurs de facteurs de capacité en réduisant la force élutropique de la phase mobile, il peut être nécessaire de tester une autre phase stationnaire capable d'offrir une meilleure rétention des analytes, par exemple en utilisant une phase stationnaire plus polaire pour les analytes polaires.
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