La variazione della pressione operativa è uno dei primi segnali di un problema cromatografico. Pertanto, è essenziale conoscere la pressione di esercizio della colonna in relazione alle dimensioni (della colonna), alla composizione della fase mobile e al flusso.
I principali problemi di pressione possono essere classificati come: nessuna pressione, bassa pressione, alta pressione e pressione estremamente variabile. La maggior parte dei problemi relativi alla pressione sono da imputarsi alla pompa LC che in continuo forza il passaggio del solvente all’interno della colonna I problemi di contropressione, più comuni e difficili, potrebbero essere dovuti a:
- Perdita dalle guarnizioni della pompa o in qualche altro punto della fluidica LC
- Ostruzione dei capillari della pompa
- “Frit” in testa della colonna ostruito
- Scelta errata del solvente
- Vuoto in colonna
- Presenza di bolle d’aria nella linea di flusso
Nessuna e/o alta contropressione
Motivazione: Se lasciamo da parte i problemi più banali, la ragione principale, sia per l’assenza di pressione che per l’alta contropressione, riguarda un blocco presente o nella colonna stessa o in qualche punto lungo la fluidica del sistema LC.
- I tamponi inorganici sono la principale causa di ostruzioni sia dei capillari della pompa sia dei “frit” colonna, nonchè all’interno dei pori dell’assorbente siliceo. Quando si usano alte concentrazioni o quando il sistema LC e le colonne non vengono puliti regolarmente/adeguatamente, si può creare altrettanto facilmente un ostruzione sia nei tubi sia del “frit” colonna.
- Oltre ai tamponi, anche alcuni analiti o matrici complesse possono accumularsi sia sul “frit” all’ingresso della colonna che all’interno dei pori dell’assorbente di silice, causando il blocco completo della colonna e l’interruzione del flusso. Uno di questi analiti/campioni è lo zucchero, soprattutto in condizioni di alto organico, in quanto gli zuccheri possono cristallizzare all’interno dei pori della colonna e hanno la capacità di bloccarne completamente il flusso.
- Di contro, composti estremamente idrofobici, matrici oleose ed alcuni cannabinoidi, possono legarsi fortemente o irreversibilmente alle fasi idrofobiche C8 e C18. Sostanze grasse e oleose possono accumularsi in colonna provocando elevate contropressioni.
- Le proteine e/o composti biologici ad alto peso molecolare possono causare sia un’elevata contropressione che la completa ostruzione della collonna se non rimossi prima dell’iniezione dalle matrici del campione che le contengono. Se presenti come analita, dovrebbero essere rimossi in un momento successivo.
Soluzione: Il modo migliore per rimuovere i tamponi e le molecole che tendono a cristallizzare e depositarsi nei capillari e nei pori delle colonne, è quello di effettuare dei lavaggi con acqua di qualità HPLC ad temperatura elevata.
- Il flusso va ridotto quando si lavora per pulire il sistema HPLC o la colonna; in questo modo si da più tempo al solvente di lavaggio di dissolvere o interagire con il contaminante e rimuoverlo.
- I flussi che possono essere utilizzati variano a seconda degli ID delle colonne:
- Per 4,6/4,0mm = 0,5ml/min, 3,0mm = 0,3ml/min, 2,1mm = 0,2ml/min
- La colonna può essere lavata in contro-flusso per rimuovere i contaminanti che potrebbero essersi depositati sul “frit” della colonna. Tuttavia, quando si esegue un primo lavaggio a flusso invertito si consiglia di scollegare il rivelatore dalla colonna, altrimenti i contaminanti che vengono rilasciati dal frit della colonna si depositano nella cella del rivelatore o nell’interfaccia, che è molto più difficile da pulire. Almeno nelle fasi iniziali del lavaggio in contro-flusso, si suggerisce di scollegare la colonna dal rilevatore .
- Sia i tamponi sia gli zuccheri possono essere facilmente disciolti in acqua e quindi possono essere rimossi sia dalla fluidica che dalla colonna. L’ideale è aumentare un po’ la temperatura per facilitare la dissoluzione dei composti in acqua, in modo che possano essere facilmente rimossi.
- In generale, le fasi polari modificate e stabili al 100% in acqua, le fasi feniliche idrofile aromatiche, a esclusione ionica, a scambio ionico e GFC-SEC possono essere lavate con il 100% di acqua di qualità per HPLC.
- Le fasi idrofobiche come C8, C18, Phenyl-Hexyl, le fasi polimeriche, le fasi GPC-SEC e le fasi chirali basate su polisaccaridi non dovrebbero mai essere pulite con il 100% di acqua, in quanto la possibilità che si verifichi il collasso idrofobico o l’idrolisi della fase è molto alta.
Poiché la fase inversa rappresenta la modalità separativa più comunemente usata in cromatografia, affronteremo i punti salienti delle procedure per la pulizia delle colonne RP per capire cosa va evitato e come risolvere problemi di pressione durante l’analisi cromatografica.
- Si ricorda che i tamponi e alcuni additivi aggressivi presenti nella fase mobile possono causare danni nella colonna. Tuttavia, il motivo principale del deterioramento della colonna avviene prinicalmente a causa della grande varietà di matrici e campioni complessi analizzati. I produttori di colonne raccomandano l’utilizzo di sali e solventi di qualità HPLC-MS per la preparazione della fase mobile e anche di utilizzare filtri a membrana da 0,2µ per filtrare la fase mobile dopo la preparazione. Pertanto, le possibilità di contaminazioni provenienti dalla fase mobile possono essere facilmente evitate o diventare trascurabili. E’ ragionevole, pertanto, considerare anche la scelta del diluente (ad eccezione di eventuali tamponi o solventi aggressivi) ai fini della pulizia della colonna. Il diluente per campioni può essere considerato il miglior solvente per pulire le colonne.
- Varie combinazioni di acqua, metanolo e ACN dovrebbero essere i primi solventi utilizzati per la pulizia della colonna, in base alla composizione della fase mobile e del diluente del campione.
- Per la rimozione di contaminanti non polari dalle colonne, possono essere utilizzati diversi solventi, quali ad esempio l’alcool isopropilico (IPA), il cloruro di metilene, l’esano, l’eptano ecc. Tuttavia, quando si utilizzano questi solventi nelle colonne LC, si raccomanda di effettuare il lavaggio della colonna prima con acqua e poi con metanolo per evitare che tali solventi rimangano all’interno della colonna.
- Per la rimozione delle proteine, se il lavaggio iniziale con acqua e metanolo non aiuta, allora si dovrebbe ricorrere a un lavaggio a gradiente con 0,1% TFA in acqua e 0,1% TFA in ACN.
Per una contaminazione proteica più resistente della fase stazionaria, il tetraidrofurano (THF) o il dimetil solfossido (DMSO) possono essere usati come solventi per il lavaggio. - Altri solventi che possono rimuovere efficacemente le proteine dalle colonne sono il cloridrato di guanidina e l’urea. Tuttavia, quando si utilizzano questi solventi nelle colonne LC, si raccomanda di effettuare il lavaggio della colonna prima con acqua e poi con metanolo per evitare che tali solventi rimangano all’interno della colonna.
