La variation de la pression de fonctionnement est l’un des premiers signes indiquant un problème dans l’analyse chromatographique. Il est donc absolument nécessaire de savoir quelle est la pression normale en fonction des dimensions de votre colonne, de la composition de la phase mobile et du débit.
Les problèmes typiques de contre-pression peuvent être classés comme suit : absence de pression, pression faible, pression élevée et pression irrégulière. La pompe LC est l’instrument qui génère la pression et constitue par conséquent la cause principale de la plupart des problèmes liés à la pression. Des causes plus complexes à l’origine de problèmes de contre-pression peuvent être :
- Des fuites au niveau des joints de la pompe ou localisées le long de la ligne d’écoulement.
- Un bouchage des capillaires de la pompe
- Un bouchage au niveau de l’injecteur de la colonne
- Un mauvais choix du solvant
- La présence d’un vide dans la colonne
- Présence de bulles d’air dans la conduite d’écoulement
Une contre-pression nulle et/ou élevée
Causes : Mis à part les problèmes les plus évidents, la cause principale d’une absence de pression ou d’une contre-pression élevée peut être un bouchage soit dans la colonne elle-même, soit quelque part dans la ligne d’écoulement.
- Les tampons utilisant des sels inorganiques sont les principaux responsables de ces phénomènes de bouchage dans les capillaires des pompes, en tête de colonnes et même à l’intérieur des pores de la phase stationnaire à base de silice. Lorsqu’ils sont utilisés à des concentrations élevées ou lorsque le système LC et les colonnes ne sont pas nettoyés régulièrement/correctement, un bouchage peut facilement se former, à la fois dans les capillaires et en tête de colonne.
- En dehors des tampons, certains analytes ou des éléments de la matrices des échantillons peuvent également s’accumuler en tête de colonne ou à l’intérieur des pores de la colonne à base de silice et ainsi boucher complètement la colonne et stopper le débit. Par exemple, la présence de sucre dans la phase mobile avec une forte proportion de solvant organique va provoquer une cristallisation à l’intérieur des pores de la colonne et stopper complètement le débit dans la colonne.
- Il arrive également que des composés très apolaires ou des matrices huileuses, par exemple certains cannabinoïdes, forment des liaisons fortes ou irréversibles avec des colonnes de phases hydrophobes C8 et C18. Ces substances grasses, semblables à de l’huile, s’accumulent au fur et à mesure dans la colonne et peuvent, à terme, causer des contre-pressions élevées.
- Les protéines ou des biomolécules de masse moléculaire élevée peuvent également provoquer une contre-pression élevée ou des bouchages si elles ne sont pas éliminées des échantillons avant de procéder à l’injection (si ces molécules ne sont pas les analytes).
Solutions : La meilleure façon d’éliminer les tampons et les composés qui peuvent cristalliser et se déposer dans les capillaires et les pores des colonnes est de nettoyer ces derniers avec de l’eau de qualité HPLC à une température élevée.
- Le débit doit presque toujours être réduit lors du nettoyage de votre système ou de votre colonne afin de laisser suffisamment de temps au solvant de nettoyage de dissoudre ou d’interagir avec le contaminant et l’éliminer.
- Les débits suivants peuvent être utilisés en fonction des DI des colonnes :
- colonnes de 4,6/4,0 mm = débit de 0,5 ml/min, colonne de 3,0 mm = 0,3 ml/min, colonne de 2,1 mm = débit de 0,2 ml/min
- Un rinçage inversé est nécessaire pour éliminer les contaminants qui pourraient se déposer sur les frittés en tête de colonne. Cependant, il est très important de noter le point suivant lorsqu’on effectue un rinçage inversé dans la colonne : il faut en effet vous assurer que vous avez déconnecté le détecteur de la colonne sinon, les contaminants qui seront élués du fritté en tête de votre colonne vont se déposer sur la cellule de détection ou sur l’interface, ce qui sera beaucoup plus difficile à nettoyer. Au moins au début du rinçage inversé, déconnecter le détecteur de la ligne d’écoulement.
- Les tampons et les sucres peuvent facilement être dissous dans l’eau et peuvent donc être éliminés du tube capillaire et de la colonne. Idéalement, se placer à une température un peu élevée pour faciliter la dissolution de ces composés dans l’eau, afin qu’ils puissent être facilement éliminés.
- En général, les phases polaires modifiées et stables en milieu 100% aqueux, les phases hydrophiles aromatiques phényl, les phases d’exclusions d’ions, d’échanges d’ions ou encore les phases GFC-SEC peuvent être nettoyées avec 100% d’eau de qualité HPLC.
- Les phases hydrophobes telles que C8, C18, Phenyl-Hexyl, les phases inverses polymériques, les phases GFC-SEC et phases chirales à base de polysaccharides ne doivent jamais être nettoyées avec 100 % d’eau sinon, il est fort probable qu’un effondrement hydrophobe se produise, ou bien une perte du ligand.
Comme la phase inverse est le mode le plus couramment utilisé en chromatographie, nous allons revoir quelques points relatifs aux procédures de nettoyages appropriées concernant les colonnes RP afin d’éviter ou résoudre des problèmes d’absence de pression ou de pression élevée pendant les analyses
- Souvenez-vous : les tampons et certains additifs de phases mobiles peuvent endommager la colonne, cependant, la principale cause de la détérioration d’une colonne est due à son exposition à une variété de matrices d’échantillons complexes et d’analytes. Les fabricants de colonnes recommandent l’utilisation de sels et de solvants de qualité HPLC/spectrométrie de masse afin de préparer la phase mobile et également d’utiliser une membrane filtrante de 0.2 µm pour filtrer la phase mobile après sa préparation. Ainsi, les risques de contamination dûs à la phase mobile peuvent être facilement évités ou négligés. Il est donc raisonnable et également essentiel de choisir les diluants de vos échantillons (sans tampons ou solvants forts) à des fins de nettoyage de colonne. Le diluant de l’échantillon peut être considéré comme étant le meilleur solvant pour nettoyer vos colonnes.
- Différentes combinaisons d’eau, de méthanol et d’acétonitrile peuvent être les premiers solvants à utiliser pour nettoyer la colonne, en fonction de la composition de la phase mobile et du diluant de l’échantillon.
- Pour éliminer les contaminants apolaires des colonnes, des solvants différents peuvent être utilisés, comme l’isopropanol (IPA), le dichlorométhane, l’hexane, l’heptane, etc. Cependant, en utilisant ces solvants dans les colonnes LC, il est recommandé de nettoyer la colonne avec de l’eau et avec du méthanol par la suite afin qu’il ne reste aucune trace de ces solvants forts dans la colonne.
- Pour éliminer les protéines, si le premier lavage à l’eau et au méthanol n’est pas suffisant, un lavage en mode gradient avec 0,1 % de TFA dans l’eau et 0,1 % de TFA dans l’acétonitrile doit être effectué.
En cas d’une forte contamination protéique dans la phase stationnaire, le tétrahydrofurane (THF) ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) peuvent être utilisés comme solvants de nettoyage - Les autres solvants pouvant éliminer les protéines de manière efficace sont le l’hydrochlorure de guanidine et l’urée. Cependant, en utilisant ces solvants sur les colonnes LC, il est recommandé de nettoyer ensuite la colonne avec de l’eau et du méthanol afin qu’il ne reste aucune trace de ces solvants dans la colonne.
