Eine Änderung des Betriebsdrucks ist eines der ersten Anzeichen für ein Problem bei der chromatographischen Analyse. Daher ist es unbedingt erforderlich, den normalen Druck in Abhängikeit von den Abmessungen der Säule, der Zusammensetzung der mobilen Phase und der Flussrate zu kennen.
Typische Rückdruckprobleme lassen sich in folgende Kategorien einteilen: kein Druck, niedriger Druck, hoher Druck und unregelmäßige Druckschwankungen. In der Pumpe des HPLC-Systems wird der Druck erzeugt und daher ist sie auch der Hauptgrund für die meisten Druckprobleme. Die komplexeren Ursachen für Rückdruckprobleme können folgende sein:
- Leckage an den Pumpendichtungen oder irgendwo in der Zulaufleitung
- Verstopfung der Kapillaren der Pumpe
- Der Säuleneinlass ist blockiert
- Falsche Wahl des Lösungsmittels
- Totvolumen in der Säule
- Luftblasen in der Durchflussleitung
Kein und/oder hoher Rückdruck
Ursache: Wenn wir die trivialeren Ursachen beiseite lassen, ist der Hauptgrund für einen fehlenden Druck oder zu hohen Rückdruck eine Verstopfung entweder in der Säule selbst oder irgendwo in den Durchflussleitungen.
- Anorganische Puffersalze sind die Hauptursache für solche Verstopfungen in den Pumpenkapillaren oder dem Säuleneinlass oder sogar in den Poren des Kieselgel-Packungsmaterials. Bei Verwendung in hohen Konzentrationen oder wenn das HPLC-System und die Säulen nicht regelmäßig bzw. ordnungsgemäß gereinigt werden, kann es leicht zu Verstopfungen kommen, möglicherweise sowohl in den Kapillaren als auch am Säuleneinlass.
- Neben Puffern können sich auch einige Analyten oder Probenmatrices am Säuleneinlass oder in den Poren des Kieselgel-Sorbens ansreichern und die Säule vollständig blockieren und somit den Fluss unterbrechen. Einer dieser Analyten/Proben ist Zucker, der vor allem unter stark organischen Bedingungen der mobilen Phase in den Poren der Säule auskristallisieren und auf diese Weise den Fluss durch die Säule vollständig blockieren kann.
- Manchmal können sich auch extrem unpolare Verbindungen oder ölige Matrices, wie z. B. einige Cannabinoide, stark oder irreversibel an hydrophobe C8- und C18-Phasen binden. Diese fettigen, öl-ähnlichen Substanzen reichern sich immer wieder auf der Säule an und können schließlich zu hohen Rückdrücken führen.
- Proteine oder andere biologische Verbindungen mit hohem Molekulargewicht können ebenfalls einen hohen Rückdruck oder Verstopfungen verursachen, wenn sie nicht vor der Injektion aus der Probenmatrix entfernt werden. Wenn sie selbst der Analyt sind, sollten sie nach der Analyse vollständig entfernt werden.
Lösung: Puffer und auskristallisierbare Verbindungen, die sich in den Kapillaren und den Poren der Säule ablagern können, lassen sich am besten durch die Reinigung mit HPLC Grade Wasser bei erhöhter Temperatur entfernen.
- Die Flussrate sollte beim Spülen Ihres Systems oder Ihrer Säule fast immer reduziert werden, um dem Waschlösungsmittel genügend Zeit zu geben, die Verunreinigung entweder aufzulösen oder mit ihr zu interagieren, um sie so zu entfernen.
- Die folgenden Flussraten können je nach Säulen-ID verwendet werden:
- Für 4,6/4,0 mm = 0,5 ml/min, 3,0 mm = 0,3 ml/min, 2,1 mm = 0,2 ml/min
- Das Rückspülen ist erforderlich, um die Verunreinigungen, die sich auf den Säuleneinlassfritten ablagern können, zu entfernen. Bei der Durchführung des ersten Rückspülens der Säule sollte jedoch unbedingt darauf geachtet werden, dass der Detektor von der Säule getrennt wird, da sich sonst die Verunreinigungen, die von der Einlassfritt der Säule lösen, in der Durchflusszelle des Detektors oder anderen Oberflächen des Systems ablagern - was die Reinigung erheblich erschwert. Entfernen Sie den Detektor zumindest für die ersten Schritte des Rückspülens aus dem Fliessweg.
- Sowohl Puffer als auch Zucker lassen sich leicht mit Wasser auflösen und können daher aus den Kapillaren und der Säule entfernt werden. Ideal ist es, wenn die Temperatur etwas höher ist, um das Auflösen dieser Verbindungen in Wasser zu erleichtern, so dass sie sich leicht entfernen lassen.
- Im Allgemeinen können polar-modifizierte und 100 % wasserstabile, aromatische hydrophile Phenyl-, Ionenausschluss-, Ionenaustausch- und GFC-SEC-Phasen mit 100 % HPLC Grade Wasser gereinigt werden.
- Hydrophobe Phasen wie C8-, C18-, Phenyl-Hexyl-, polymere Umkehrphasen, GPC-SEC-Phasen und chirale Phasen auf Polysaccharid-Basis sollten niemals mit 100 % Wasser gereinigt werden, da sonst die Gefahr eines „hydrophoben Kollaps“ oder einer Abspaltung der gebundenen Liganden besteht.
Da die Umkehrphase in der Chromatographie am häufigsten verwendet wird, werden wir einige Punkte zu geeigneten Reinigungsverfahren für Umkehrphasen-Säulen erörtern, um Probleme mit zu hohem oder fehlendem Druck während der Analyse zu vermeiden und zu beheben.
- Bedenken Sie, dass Puffer und einige aggressive Additive der mobilen Phase die Säule beschädigen können. Der Hauptgrund für die Verschlechterung der Säulenleistung liegt jedoch in einer Vielzahl komplexer Probenmatrices und Analyten. Die Säulenhersteller empfehlen die Verwendung von Salzen und Lösungsmitteln in hochreiner HPLC- / Massenspektrometrie-Qualität für das Ansetzen der mobilen Phase sowie die Verwendung von 0,2 µm Membranfiltern zum Filtrieren der mobilen Phase nach dem Ansetzen, sodass die Gefahr einer Kontamination durch die mobile Phase ausgeschlossen oder zumindest deutlich verringert werden kann. Es ist daher sinnvoll und wichtig, dass Sie Ihr Lösungsmittel (ohne Puffer oder aggressive Zusätze) zur Säulenreinigung besonders sorgfältig auswählen. Das Probenlösungsmittel kann als das beste Lösungsmittel zur Reinigung Ihrer Säulen angesehen werden.
- Je nach der Zusammensetzung der mobilen Phase und des Probenlösungsmittels sollten verschiedene Kombinationen von Wasser, Methanol und ACN als erstes Lösungsmittel für die Säulenreinigung verwendet werden.
- Für die Entfernung unpolarer Verunreinigungen von Säulen können verschiedene mittelpolare Lösungsmittel verwendet werden, z.B. Isopropylalkohol (IPA), Ethanol oder THF usw. Bei Verwendung dieser Lösungsmittel in HPLC-Säulen wird jedoch empfohlen, die Säule anschließend mit Wasser und Methanol zu spülen, damit keine Spuren dieser starken Lösungsmittel in der Säule verbleiben.
- Wenn das anfängliche Spülen mit Wasser und Methanol nicht hilft, sollte zur Proteinentfernung eine Gradientenprogramm mit 0,1 % TFA in Wasser und 0,1 % TFA in ACN durchgeführt werden.
Bei stärkeren Proteinverunreinigungen auf der stationären Phase können Tetrahydrofuran (THF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) als Spüllösungsmittel verwendet werden. - Weitere Lösungsmittel, die Proteine wirksam von Säulen entfernen können, sind Guanidinhydrochlorid und Harnstoff. Bei der Verwendung dieser Lösungsmittel in HPLC-Säulen wird jedoch empfohlen, die Säule anschließend noch mit Wasser und Methanol zu spülen, damit keine Spuren dieser Lösungsmittel in der Säule verbleiben.
