Změna provozního tlaku je jedním z prvních příznaků problému při chromatografické analýze. Proto je naprosto nezbytné vědět, jaký je běžný tlak ve vztahu k rozměrům Vaší kolony, složení mobilní fáze a průtoku.
Typické problémy s protitlakem lze rozdělit do následujících kategorií: žádný tlak, nízký tlak, vysoký tlak a kolísavý tlak. LC pumpa je zdrojem generování tlaku, a proto je také hlavním důvodem většiny problémů s tlakem. Ke složitějším příčinám problémů s protitlakem patří následující:
- Únik z těsnění pumpy nebo někde v průtokové cestě
- Ucpání kapilár pumpy
- Ucpaný vstup do kolony
- Nesprávná volba rozpouštědla
- Prázdný prostor tzv. void v koloně
- Vzduchové bubliny v průtokové cestě
Žádný a/nebo vysoký protitlak
Důvod: Pokud pomineme banálnější problémy, je hlavní příčinou absence tlaku nebo vysokého protitlaku ucpání buď samotné kolony, nebo průtokové cesty.
- Hlavním viníkem ucpávání v kapilárách a na vstupech do kolon, nebo dokonce uvnitř pórů samotné siliky jsou anorganické pufrovací soli. Při použití pufrů ve vysokých koncentracích nebo pokud se LC systém a kolony pravidelně/správně nečistí, může snadno dojít k ucpání, a to jak v hadičkách, tak na vstupu do kolony.
- Kromě pufrů se mohou na vstupech do kolony nebo uvnitř pórů siliky nahromadit také některé analyty nebo matrice vzorku a mohou zcela zablokovat kolonu a zastavit průtok. Jedním z takových analytů/vzorků jsou cukry, zejména v podmínkách s vysokým obsahem organiky v mobilní fázi mohou cukry krystalizovat uvnitř pórů kolony a tak zcela zablokovat průtok z kolony.
- Někdy se na hydrofobní fáze C8 a C18 mohou silně nebo nevratně vázat také extrémně nepolární sloučeniny nebo olejové matrice, např. některé kanabinoidy. Tyto látky podobné mastným olejům se na koloně stále hromadí a nakonec mohou způsobit vysoké protitlaky.
- Vysoký protitlak nebo ucpání mohou způsobit i proteiny nebo několik vysokomolekulárních biologických sloučenin, pokud nejsou odstraněny z matric vzorků ještě před nástřikem. Pokud jsou přítomny jako analyt, měly by být odstraněny později.
Řešení: Nejlepší způsob, jak odstranit pufr a sloučeniny, které mohou krystalizovat a usazovat se v kapilárách a pórech kolon, je čištění vodou v čistotě HPLC při zvýšené teplotě.
- Při čištění systému nebo kolony by měla být téměř vždy snížena průtoková rychlost, aby byl zajištěn dostatek času na to, aby promývací rozpouštědlo rozpustilo kontaminant nebo s ním interagovalo a tak ho odstranilo.
- V závislosti na ID kolony lze použít následující průtoky:
- Pro 4,6/4,0 mm = 0,5 ml/min, 3,0 mm = 0,3 ml/min, 2,1 mm = 0,2 ml/min
- K odstranění kontaminantů, které by se mohly usazovat na vstupních fritách kolony, je zapotřebí zpětný proplach. Existuje však jedna důležitá podmínka, která by měla být splněna při provádění počátečního zpětného proplachu v koloně. Ujistěte se, že jste odpojili detektor od kolony, jinak se nečistoty, které se budou eluovat z (vstupních frit) kolony, usadí v průtokové cele detektoru nebo na rozhraní, které se mnohem obtížněji čistí. Přinejmenším v počátečních krocích zpětného proplachu odpojte detektor od průtokové cesty.
- Pufry i cukry se snadno rozpouštějí ve vodě, a proto je lze z hadiček a kolony odstranit. Ideální je zajistit trochu vyšší teplotu, která usnadní rozpouštění těchto sloučenin ve vodě, aby je bylo možné snadno odstranit.
- Obecně lze čistit 100% vodou v HPLC kvalitě polární fáze, fáze odolné ve 100% vody, aromatické hydrofilní fenylové fáze, IEX a GFC-SEC fáze.
- Hydrofobní fáze, jako jsou C8, C18, fenyl-hexyl, polymerní reverzní fáze, GPC-SEC fáze a chirální fáze na bázi polysacharidů, by se nikdy neměly čistit 100% vodou, jinak je vysoká pravděpodobnost hydrofobního kolapsu nebo rozštěpení vázaného ligandu.
Vzhledem k tomu, že reverzní fáze je nejčastěji používanou fází v chromatografii, probereme několik bodů o vhodných postupech čištění RP kolon, abychom se vyhnuli problémům s vysokým a nulovým tlakem během analýzy a vyřešili je.
- Nezapomeňte, že pufry a několik ,,drsných“ přísad mobilní fáze způsobují poškození kolony, nicméně hlavním důvodem poškození kolony bývají různé komplexní matrice vzorků a analytů. Výrobci kolon doporučují používat soli a rozpouštědla v čistotě HPLC / MS a také používat 0,2µ membránové filtry k filtraci po přípravě mobilní fáze, takže kontaminaci pocházející z MF lze snadno zabránit nebo je zanedbatelná . Proto by mělo být rozumné zvážit a také nezbytné, abyste si pro účely čištění kolony vybrali ředící roztok vzorků (bez jakýchkoli pufrů nebo ,,drsných“ rozpouštědel). Ředící roztok vzorků může být považováno za nejlepší rozpouštědlo pro čištění vašich kolon.
- Prvními rozpouštědly použitými pro účely čištění kolon, v závislosti na složení mobilní fáze a ředícího roztoku vzorků, by měly být různé kombinace vody, methanolu a ACN.
- Pro odstranění nepolárních kontaminantů z kolon lze použít více různých rozpouštědel: isopropylalkohol (IPA), methylenchlorid, hexan a heptan atd. Při použití těchto rozpouštědel v LC kolonách se však doporučuje následně vyčistit kolonu vodou a methanolem, aby uvnitř kolony nezůstaly žádné stopy těchto silných rozpouštědel.
- Pro odstranění proteinu, pokud počáteční promývání vodou a methanolem nepomůže, je třeba použít gradientové promývání s 0,1 % TFA ve vodě a 0,1 % TFA v ACN.
V případě výraznějšího znečištění stacionární fáze proteiny lze jako promývací rozpouštědla použít tetrahydrofuran (THF) nebo dimethylsulfoxid (DMSO). - Dalšími rozpouštědly, která mohou účinně odstranit proteiny z kolon, jsou guanidin-hydrochlorid a močovina. Při použití těchto rozpouštědel v LC kolonách se však doporučuje následně vyčistit kolonu vodou a methanolem, aby uvnitř kolony nezůstaly žádné stopy těchto rozpouštědel.
