Metoda HPLC - Dlaczego jest ważna?
Poniższe ulepszenia związane z metodą poprawią wydajność w przypadku wszystkich rozdzieleń na kolumnach. W przypadku korzystania z kolumn typu "core-shell" następujące elementy mogą znacząco poprawić wydajność Twojej metody.
Metody HPLC powinny najpierw dążyć do skupienia próbki na górnej części kolumny, a następnie do zminimalizowania rozproszenia próbki w kolumnie. Gdy minimalizuje się poszerzenie pasma poprzez zmniejszenie rozproszenia próbki, poprawia się czułość i rozdzielczość piku.
Włączenie do metody prostego programowania dozownika może zminimalizować objętość pozakolumnową w celu poprawy kształtu piku i sprawności, zwłaszcza w przypadku szybkich rozdziałów LC.
Problem: Wszystkie piki są szerokie
1. Sprawdź objętość próbki: Błędy w podawaniu próbki mogą zniweczyć wzrost wydajności osiągany dzięki stosowaniu cząsteczek typu core-shell. Jeżeli próbka jest nastrzykiwana w tym samym składzie dodatku organicznego, co faza ruchoma i w warunkach izokratycznych, początkowa szerokość pasma na kolumnie będzie wprost proporcjonalna do objętości nastrzyku. W związku z tym, próbka o dużej objętości jest podawana jako szerokie pasmo na kolumnie i daje niską sprawność piku.
Rozwiązanie: Aby zmniejszyć straty sprawności związane z nastrzykami o dużej objętości, możliwe jest wstępne skoncentrowanie próbki na głowicy kolumny poprzez zastosowanie rozpuszczalnika słabszego niż faza ruchoma. Można również zmniejszyć objętość podawanej próbki. W przypadku stosowania kolumn o wysokiej sprawności często potrzebne są mniejsze ilości próbki w celu uzyskania dobrego sygnału odpowiedzi.
2. Sprawdź rozpuszczalnik do próbek: Jeżeli moc rozpuszczalnika organicznego jest większa niż fazy ruchomej HPLC, wówczas próbka zostanie podana jako rozproszone pasmo na szczycie kolumny HPLC. Może to wystąpić zarówno w metodach izokratycznych, jak i gradientowych i może zniweczyć wiele korzyści związanych z wydajnością, jakie zapewnia kolumna.
- Metody gradientowe, w których próbka jest podawana w rozpuszczalniku mocniejszym niż faza ruchoma, związek wykazuje efekt "uślizgu", co powoduje poszerzenie i rozdzielenie pików.
- Metody izokratyczne, w których rozpuszczalnik jest silniejszy niż faza ruchoma, spowodują nadmierne rozproszenie próbki.
Rozwiązanie: Wstrzyknij słaby rozpuszczalnik. Najlepiej jest użyć rozpuszczalnika o mocy słabszej lub równej mocy organicznej fazy ruchomej, tak aby próbka skupiała się na czole kolumny, dając ostrzejsze piki (tj. wyższą sprawność).
Cel: Dalsze skrócenie czasu analizy i objętości pików w metodach gradientowych.
Sprawdź program nastrzyków: Objętość pozakolumnowa przed kolumną spowoduje rozproszenie próbki w drodze do kolumny; pętla iniektora jest głównym źródłem dodatkowej objętości pozakolumnowej.
Rozwiązanie: Możliwe jest ominięcie pętli za pomocą programu nastrzyków w metodzie (po opuszczeniu przez próbkę pętli nastrzykowej). Tabela 1 i rysunek 1 przedstawiają przykład, w którym pętla nastrzykowa jest omijana po nastrzyku w celu zmniejszenia objętości opóźnienia systemu.
| Etapy | Polecenia | Komentarze |
|---|---|---|
| 1 | POBIERZ | Pobierz objętość próbki (objętość nastrzyku) z fiolki |
| 2 | NASTRZYK | Wprowadzenie próbki do linii przepływu |
| 3 | POCZEKAJ | Przepłukać pętlę do pobierania próbek po nastrzyku (czas oczekiwania = 6x (objętość iniekcji + 5 μL) / natężenie przepływu) |
| 4 | Zawór obejścia | Bezpośredni przepływ z pompy do kolumny, z pominięciem zaworu nastrzykowego w celu wykluczenia objętości opóźnienia (~200 - 500 μL ze ścieżki automatycznego nastrzyku) |
| 5 | Poczekaj 1,5 min. | Czas pracy zaworu obejścia (Czas oczekiwania = Czas pracy - 1 min) |
| 6 | zawór główny | Zawór przełączający z pozycji obejścia na pozycję nastrzyku |
