Ottimizzazione del Sistema HPLC per ottenere prestazioni UHPLC

Perché è così importante per il metodo HPLC

I seguenti miglioramenti aumenteranno le prestazioni per tutte le separazioni cromatografiche LC. Se si usano colonne HPLC Core-Shell, questi suggerimenti ne incrementeranno notevolmente le performance.

Un metodo HPLC dovrebbe prima di tutto focalizzare il campione in testa alla colonna, minimizzando la dispersione del campione.

La semplice programmazione dell'iniettore può ridurre al minimo il volume extra-colonna e migliorare forma ed efficienza del picco, in particolare per le separazioni LC-fast.

Problema: tutti i picchi sono larghi

1. Controlla il volume del campione: gli errori nell’iniezione del campione possono impedire alla colonna Core-Shell di raggiungere performance ultra-elevate tipiche di questo materiale. In isocratica, se si inietta il campione alla stessa concentrazione di organico della fase mobile, la larghezza di banda iniziale sarà proporzionale al volume di iniezione. Di conseguenza, un alto volume di iniezione genererà picchi larghi (bassa efficienza)..

Soluzione: Pre-concentra il tuo campione. Per ridurre la perdita di efficienza dovuta a grandi volumi di iniezione, puoi pre-concentrare il tuo campione in testa alla colonna usando solvente a più bassa concentrazione rispetto alla fase mobile.

2. Controlla il solvente di iniezione: Se il sovente di iniezione ha un potere eluente più forte della fase mobile, il campione diffonderà in testa alla colonna HPLC come una banda larga. Questo effetto si verifica sia per metodi in gradiente sia per metodi in isocratica, e impedisce il raggiungimento delle massime prestazioni della colonna.

• Per applicazioni in gradiente in cui il campione è iniettato con forza eluente maggiore della fase mobile, si avrà bassa efficienza e possibile sdoppiamento dei picchi.
• Per i metodi in isocratica, la maggiore forza eluente del campione causerà bassa efficienza.

Soluzione: Inietta in un solvente più debole. E’ sempre meglio iniettare il campione in un solvente dal potere eluente più basso rispetto alla fase mobile : così facendo il campione focalizzerà in testa alla colonna e si otterranno picchi più stretti (maggiore efficienza).

Obiettivo: Applicare gradienti ripidi UHPLC per ottenere la massima velocità e picchi più stretti

Criticità:: Volume di differimento del sistema eccessivo.

Soluzione: È tuttavia possibile bypassare la fluidica dell’autocampionatore attraverso l’esecuzione di uno specifico programma di iniezione. Ciò consente di ridurre fortemente il volume di differimento massimizzando velocità e capacità di picco. Il programma consiste nel ruotare la valvola dell’AS nella posizione di bypass non appena il campione ha quantitativamente lasciato il loop dell’iniettore. La Tabella 1 mostra un esempio di applicazione di questo tipo di programma e in Figura 1 si può osservare l’effetto sul cromatogramma.