HPLC metoda - Proč je to důležité
Následující technika související s metodou navrhuje vylepšení zvyšující výkon při všech separacích. Při použití kolon s core-shell částicemi mohou tyto techniky výrazně zlepšit výkon vaší metody.
Metody HPLC by se měly nejprve zaměřit na zaostření vzorku na vstupu kolony a poté minimalizovat disperzi vzorku kolonou. Když minimalizujete rozšíření pásma snížením rozptylu vzorku, zlepšíte citlivost a rozlišení svého píku.
Začlenění jednoduchého programování injektoru do metody může minimalizovat extra-column volume, aby se zlepšil tvar píku a účinnost, zejména pro rychlé LC separace.
Problém: Všechny píky jsou široké
1. Zkontrolujte objem nástřiku: Chyby v nasávání vzorků mohou negovat zvýšení výkonu, kterého můžete dosáhnout použitím core-shell částic. Pokud nastřikujete vzorek ve stejném organickém složení jako mobilní fáze za izokratických podmínek, bude počáteční šířka pásma na koloně přímo úměrná objemu nástřiku. Jako takový je do kolony vstřikován velkoobjemový vzorek jako široký pás a poskytuje nízkou účinnost.
Řešení: Aby se snížila ztráta účinnosti u velkoobjemových nástřiků, je možné předem koncentrovat vzorek na začátku kolony pomocí slabšího ředícího roztoku než mobilní fáze. Můžete také snížit objem nástřiku. Pokud se používají kolony s vysokou účinností, je pro získání dobré odezvy signálu často zapotřebí menší množství vzorku.
2. Zkontrolujte roztok k ředění vzorku: Pokud je organická síla roztoku větší než síla HPLC mobilní fáze, pak se vzorek nanese jako difúzní pás v čele HPLC kolony. K tomu může dojít v izokratických nebo gradientových metodách a může to negovat většinu výkonnostních výhod, které tyto kolony přináší.
- Gradientní metody, při kterých je vzorek vstřikován v silněnjším rozpouštědle než mobilní fáze, vykazuje sloučenina tzv. surfovací účinky, což způsobí, že se píky rozšíří a rozdělí.
- Izokratické metody, kde je rozpoštědlo silnější než mobilní fáze, povedou k nadměrné disperzi vzorku.
Řešení: Nastříkněte slabé rozpouštědlo. Nejlepší je použít ředící roztok, který je slabší nebo rovnen organické síle mobilní fáze, aby se vzorek soustředil na začátku kolony, což by mělo za následek ostřejší píky (tj. vyšší účinnost).
Cíl: Dále zkrátit čas metody (runtime) a kapacita píků v gradientových metodách
Zkontrolujte vstřikovací program: Extra-column volume předtím než způsobí disperzi vzorku na cestě do kolony; nástřiková smyčka je hlavním zdrojem extra-column volume.
Řešení: Během analytické metody (poté, co vzorek opustil injektorovou smyčku) je možné smyčku obejít injektorovým programem. Tabulka 1 a obrázek 1 ukazují příklad, kdy je vstřikovací smyčka po injekci obcházena, aby se snížil objem prodlevy systému.
| Kroky | Příkazy | Komentáře |
|---|---|---|
| 1 | ODBĚR | Odeberte objem vzorku (objem nástřiku) z vialky |
| 2 | NÁSTŘIK | Vložte vzorek do průtokové cesty |
| 3 | POČKEJTE | Propláchněte vzorkovací smyčku po nástřiku (čekací doba = 6x (objem nástřiku + 5 μL) / průtok) |
| 4 | VENTIL bypass | Přímý průtok z čerpadla do kolony, obcházení vstřikovacího ventilu, aby se vyloučil objem zpoždění (~ 200 - 500 μL z dráhy autoinjektoru) |
| 5 | POČKEJTE 1,5 min. | Doba bypassu VENTILU (čekací doba = doba chodu - 1 min) |
| 6 | VENTIL mainpass | Přepněte ventil z obtoku do polohy vstřikování |
