Suggerimento tecnico HPLC/UHPLC
Livello: Intermedio
Come sfruttare al meglio l’enetioselettività delle fasi stazionarie chirali polisaccaridiche per migliorare le separazioni enantiomeriche
Le fasi stazionarie chirali a base di polisaccaridi sono ampiamente utilizzate nella separazione di enantiomeri. Numerosi sono i vantaggi derivanti dall’utilizzo di una fase stazionaria a base di polisaccaridi, tra cui la capacità di offrire un ampio numero di interazioni derivanti dai siti chirali presenti nella molecola di zucchero utilizzata per creare la fase stazionaria. A tali molecole di zucchero è legato il selettore chirale, che è in grado di offrire un maggiore contributo nel riconoscimento rispetto alle fasi stazionarie chirali di diversa natura.
Le fasi a base di polisaccaridi offrono una buona flessibilità per quanto riguarda il tipo di fase mobile con cui si può lavorare e consentono all’operatore di utilizzare la fase normale, la fase organica polare, la fase inversa e la modalità SFC (fluido supercritico), il tutto con un’unica colonna chirale. Le fasi stazionarie sono robuste e offrono una buona capacità di carico in quanto sono a base di silice.
Il selettore chirale a base di polisaccaridi può essere rivestito o immobilizzato sulla particella di silice influenzando la selettività, sia direttamente attraverso un cambiamento nell’interazione con la fase, sia indirettamente attraverso l’uso di diversi solventi che si hanno a disposizione quando si utilizza una fase immobilizzata rispetto ad una fase rivestita.
La maggior parte delle fasi stazionarie chirali a base di polisaccaridi sono rivestite, e ciò significa che la fase stazionaria non è legata covalentemente alla silice sottostante. Negli ultimi anni, un certo numero di selettori chirali è stato immobilizzato alla particella di silice. Ciò significa che essi sono legati covalentemente implicando per tale motivo una maggiore stabilità nell’utilizzo di una più ampia gamma di solventi più aggressivi. La capacità di utilizzare una vasta gamma di solventi ha aumentato le opzioni di selettività di questi selettori chirali e qui di seguito diamo alcuni suggerimenti su come massimizzare la selettività chirale utilizzando fasi stazionarie chirali a base di polisaccaridi immobilizzati.
Con una fase immobilizzata si ha a disposizione una più ampia gamma di solventi organici da utilizzare durante lo sviluppo di un metodo. Questo può consentire di risolvere enantiomeri notoriamente problematici lavorando con solventi organici più forti.
In questo caso la risoluzione dell’Ornidazolo si ottiene nella fase immobilizzata Cellulose-5 introducendo MtBe nella fase mobile. Tale combinazione mostra una maggiore risoluzione rispetto alla fase rivestita Cellulose-1.
| Separazione chirale di Ornidazolo su Lux 5 µ i-Celluslose-5 | |||
|---|---|---|---|
| Colonna | Lux 5µm i-Cellulose-5, LC Column, ea. | ||
| Dimensioni | 250 x 4,6 mm ID | ||
| Codice | 00G-4756-E0 | ||
| Modalità di eluizione | Isocratica | ||
| Eluente A | 0,1% Etilammine in MtBE | ||
| Flusso | 1 mL/min | ||
| Temperatura della colonna | ambiente | ||
| Rivelatore | UV-Vis- lunghezza d'onda variabile @ 254 nm (T Ambiente) | ||
| Ornidazolo su Lux 5 µm Cellulose-1 in NP | |||
|---|---|---|---|
| Colonna | Lux 5µm Cellulose-1, LC Column, ea. | ||
| Dimensioni | 250 x 4,6 mm ID | ||
| Codice | 00G-4459-E0 | ||
| Modalità di eluizione | Isocratica | ||
| Eluente A | Esano/ EtOH (80:20) DEA (0,1%) | ||
| Flusso | 1 mL/min | ||
| Temperatura della colonna | ambiente | ||
| Rivelatore | UV-Vis- lunghezza d'onda variabile @ 220 nm (T Ambiente) | ||
Iniezione mediante l’utilizzo di solventi organici forti:
Molte applicazioni richiedono l’uso di un forte solvente organico. In presenza di una fase rivestita, ciò può portare alla dissoluzione della fase stazionaria e perdita di selettività. Con una fase immobilizzata non si verificano danni e la selettività viene mantenuta nel tempo per tutta la durata della colonna. In questo caso, non vediamo alcun cambiamento nella risoluzione quando si utilizza una fase immobilizzata anche utilizzando il DMSO come solvente di iniezione.
| Condizioni per tutte le colonne | |||
|---|---|---|---|
| Colonna | Lux 5µm i-Cellulose-5 | ||
| Dimensioni | 250 x 4,6 mm ID | ||
| Codice | 00G-4756-E0 | ||
| Fase Mobile | Methanol/DEA (100:0.1) | ||
| Flusso | 1,5 mL/min | ||
| Rivelatore | UV @ 280 nm | ||
| Temperatura | 27 C | ||
| Campione | Laudanosine | ||
| Diluente | Dimetil sulfossido (DMSO) | ||
Riassumendo, con le fasi stazionarie chirali a base di polisaccaridi si ha a disposizione una vasta gamma di selettività chirali complementari. Questo può contribuire a garantire una buona risoluzione enantiomerica per quasi tutte le molecole chirali quando si applica un processo di screening metodico e approfondito.
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