Astuces techniques sur la préparation d’échantillon
Niveau : débutant
Procédures de prétraitement d’échantillon pour les échantillons biologiques
En raison de leur nature, les échantillons biologiques ont souvent besoin d’une étape de prétraitement avant le nettoyage par extraction en phase solide (SPE). Chaque matrice d'échantillon propose des défis différents, tels que l'élimination des protéines du plasma et du sérum, la séparation des globules rouges dans le sang total, l'hydrolyse des analytes glucuronidés dans l'urine et l'homogénéisation des échantillons de tissus. Cette astuce technique décrit des procédures communes de prétraitement des échantillons pour les échantillons biologiques.
Plasma / Sérum
Les prétraitements du plasma et du sérum dépendent de l'analyte. Si l'analyte cible est un acide, on peut utiliser 2% d'acide phosphorique (20 μl de H3PO4 à 85% pour 1 ml de plasma ou de sérum) pour perturber l'interaction médicament-protéine. Si l'analyte cible est basique, on peut dans ce cas utiliser de l'hydroxyde de sodium 0,1 M. Après l’ajout d'un acide ou d’une base, l'échantillon doit être vortexé pendant 20 à 30 secondes, puis centrifugé. Le surnageant est alors prêt l’analyse.
Sang total
Plusieurs stratégies de prétraitement pour le sang total sont possibles. Une étape d'hémolyse est nécessaire lorsque l'analyte cible est présent dans les globules rouges.
• Hémolyse : mettre 0,2 ml de sang total (additionné d'analytes et d'étalon interne) dans un tube à centrifuger de 1,2 ml et y ajouter 400 μl de sulfate de zinc à 2% / méthanol à 80%. Vortexer pendant 10-20 secondes puis centrifuger à 14 000 tr / min pendant 10 minutes. Récupérer le surnageant pour une analyse plus approfondie.
Préparation du sulfate de zinc / méthanol : ajouter 20 ml d'eau et 3,6 g de ZnSO4, 7H2O dans un flacon volumétrique de 100 ml. Lorsque la solution est claire et que les cristaux de sel sont dissous, ajouter le méthanol à 100%. Réfrigérer la solution à 2-8 ° C pendant 7 jours.
• Décomposition osmotique : ajouter 1 ml de sang total à l'étalon interne et 4 ml d'eau distillée. Mélanger / vortexer et laisser reposer 5 minutes. Centrifuger à 670 g pendant 10 minutes et jeter la boulette. Ajuster le pH du surnageant en conséquence avec l'ajout d'une solution tampon.
• Sonication : Effectuer une sonication de 1 ml de sang total pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter 3-6 ml d'un tampon au pH approprié (tel que le tampon phosphate de potassium). Mélanger / vortexer. Laisser reposer 5 minutes. Centrifuger à 670 g pendant 15 minutes. Analyser le surnageant.
Remarque : Une comparaison des techniques de prétraitement du sang total ci-dessus a été réalisée pour les médicaments acides, basiques et neutres. Les taux de récupération étaient généralement les plus élevés lorsque l'échantillon de sang total était dilué avec un tampon et soumis à une dénaturation physique (sonication) que lorsqu’il était soumis à un traitement chimique. En fait, le processus de sonication défait les membranes cellulaires si bien qu’aucun bouchage n'a été observé lorsque la procédure indiquée ci-dessus a été suivie.1
Salive
Aucune hydrolyse n'est requise pour les liquides oraux ; il est possible de suivre le protocole générique utilisé pour le prétraitement du plasma / sérum.
Urine
L'hydrolyse enzymatique est nécessaire dans le cas de formes conjuguées (forme sulfatée ou glucuronide) de l'analyte présent. L'hydrolyse enzymatique nécessite une gamme de pH (pH 4-5) et de température spécifiques. Il est possible d’effectuer également une hydrolyse acide ou basique, en fonction de la stabilité du composé.
• Hydrolyse enzymatique : A 500 μl d'échantillon (additionné de l'analyte et de l'étalon interne), ajouter 100 μl de tampon acide (voir ci-dessous) et 20 μl de bêta-glucuronidase. Vortexer pendant 5-6 secondes. Incuber dans un bain d'eau à 63 ° C pendant 30 minutes. Transférer l'échantillon dans une plaque de récupération 96 puits ou dans un vial pour passeur automatique. Sceller et centrifuger pendant 10 minutes à 2 000 tr / min.
Préparation du tampon acide (tampon acétate 1,0 M, pH 4,0) : Dissoudre 3,0 g d'acide acétique glacial et 4,1 g d'acétate de sodium dans un flacon volumétrique de 1 l.
• Hydrolyse basique : A 1 ml d'urine (additionnée de l'analyte et de l'étalon interne), ajouter 100 μl de KOH 10 N. Mélanger, vortexer et hydrolyser pendant 20 minutes à 60 ° C. Refroidir et ajuster le pH à 3,5- 4,0 (en ajoutant 200 µl d'acide acétique glacial).
• Hydrolyse acide : A 1 ml d'urine, ajouter 0,25 ml de HCl dans un tube à essai à bouchon à vis. Visser légèrement le dessus du tube et chauffer dans un bain d'eau bouillante pendant 60 minutes. Ajuster à pH 7 (ou au besoin) avec 1,0 N de NaOH.
Tissu
Homogénéiser avec un solvant organique ou aqueux selon la solubilité de l'analyte. Laisser déposer, décanter, centrifuger ou filtrer le surnageant. Effectuer la dispersion de la matrice en phase solide (MSPD) directement sur le tissu.
References: 1. Chen et al., J. Anal. Toxicol. 1992, v18, pages 352-355
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