Wskazówka techniczna dotycząca przygotowania próbki
Poziom: Podstawy
Procedury wstępnej obróbki próbek biologicznych
Ze względu na swój charakter, próbki bioanalityczne często wymagają etapu obróbki wstępnej przed dalszym oczyszczaniem za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Każda matryca próbki stwarza własne unikalne wyzwania, takie jak usuwanie białek z osocza i surowicy, rozbijanie czerwonych krwinek w pełnej krwi, hydroliza glukuronidowanych analitów w moczu czy homogenizacja próbek tkanek. W niniejszej nocie technicznej przedstawiono typowe procedury wstępnej obróbki próbek bioanalitycznych.
Osocze/surowica
Obróbka wstępna osocza i surowicy zależy od analitu. Jeśli interesujący analit jest kwasem, można użyć 2% kwasu fosforowego (20 µl 85% H3PO4 na 1 ml osocza lub surowicy), aby zakłócić interakcję lek-białko. Jeśli interesujący analit jest zasadą, można użyć 0,1 M wodorotlenku sodu w celu przerwania oddziaływań lek-białko. Po dodaniu kwasu lub zasady próbkę należy wytrząsać przez 20-30 sekund, a następnie odwirować. Supernatant jest gotowy do dalszej analizy.
Krew pełna
Istnieje kilka strategii obróbki wstępnej, które można zastosować w przypadku krwi pełnej. Jeśli docelowy analit jest obecny w czerwonych krwinkach, konieczny jest etap hemolizy.
• Hemoliza: Do 0,2 ml krwi pełnej (wzbogaconej analitami i wzorcem wewnętrznym) w probówce wirówkowej o pojemności 1,2 ml dodać 400 µl 2% siarczanu cynku/80% metanolu. wytrząsać przez 10-20 sekund, a następnie wirować z prędkością 14 000 obrotów na minutę przez 10 minut. Zebrać supernatant do dalszej analizy.
Przygotowanie siarczanu cynku w metanolu: Do kolby miarowej o pojemności 100 ml dodać 20 ml wody i 3,6 g ZnSO4, 7H2O. Gdy roztwór stanie się klarowny, a kryształy soli rozpuszczą się, dodać metanolu do kreski. Przechowywać roztwór w lodówce w temperaturze 2-8 °C przez 7 dni.
• Rozkład osmotyczny: Do 1 ml krwi pełnej dodać wzorzec wewnętrzny i 4 ml wody destylowanej. Wymieszać/wytrząsać i odstawić na 5 minut. Wirować przy 670 g przez 10 minut i odrzucić osad. Dostosować odpowiednio pH supernatantu poprzez dodanie roztworu buforującego.
• Sonikacja: Sonifikować 1 ml krwi pełnej przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 3-6 ml odpowiedniego buforu pH (takiego jak bufor fosforanu potasu). Wymieszać/wytrząsać. Odstawić na 5 minut. Wirować z prędkością 670 g przez 15 minut. Supernatant poddać analizie.
Uwaga: Porównanie powyższych technik obróbki wstępnej krwi pełnej przeprowadzono dla leków o odczynie kwaśnym, zasadowym i obojętnym. Odzyski były generalnie najwyższe, gdy próbka krwi pełnej została rozcieńczona buforem i poddana denaturacji fizycznej (sonikacji), a nie środkom chemicznym. W rzeczywistości proces sonikacji zakłóca błony komórkowe w takim stopniu, że nie zaobserwowano zatykania, gdy zastosowano procedurę wymienioną powyżej.1
Ślina
W przypadku płynów ustnych nie jest wymagana hydroliza i można stosować ogólny protokół stosowany do wstępnej obróbki osocza/surowicy.
Mocz
Hydroliza enzymatyczna jest konieczna w przypadku obecności form sprzężonych (siarczanowych lub glukuronidowych) analitu. Hydroliza enzymatyczna wymaga określonego zakresu pH (pH 4-5) i temperatury. Można również przeprowadzić hydrolizę kwasową lub zasadową, w zależności od stabilności związku.
1. Hydroliza enzymatyczna: Do 500 µL próbki (wzbogaconej analitem i wzorcem wewnętrznym) dodać 100 µL kwaśnego buforu (patrz poniżej) i 20 µL beta-glukuronidazy. Wytrząsać przez 5-6 sekund. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 63 °C przez 30 minut. Przenieść próbkę do 96-dołkowej płytki zbiorczej lub fiolki do autosamplerem. Zamknąć i wirować przez 10 minut z prędkością 2000 obrotów na minutę.
Przygotowanie kwaśnego buforu (1,0 M bufor octanowy, pH 4,0): Rozpuścić 3,0 g lodowatego kwasu octowego i 4,1 g octanu sodu w kolbie miarowej o pojemności 1 L.
2. Hydroliza zasadowa: Do 1 ml moczu (wzbogaconego analitem i wzorcem wewnętrznym) dodać 100 µl 10 N KOH. Wymieszać, wytrząsać i hydrolizować przez 20 minut w temperaturze 60˚C. Schłodzić i dostosować pH do 3,5-4,0 (dodając 200 µl lodowatego kwasu octowego).
3. Hydroliza kwasowa: Do 1 ml moczu dodać 0,25 ml HCl w zakręcanej probówce. Zakręcić luźno górną część probówki i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 60 minut. Doprowadzić do pH 7 (w razie potrzeby) za pomocą 1,0 N NaOH.
Tkanki
Homogenizować rozpuszczalnikiem organicznym lub wodnym w zależności od rozpuszczalności analitu. Osadzić, zdekantować, odwirować lub przefiltrować supernatant. Przeprowadzić bezpośrednią ekstrakcję MSPD (Matrix Solid Phase Dispersion) na tkance.
Odniesienie: 1. Chen et al., J. Anal. Toxicol. 1992, v18, strony 352-355
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
CONNECT WITH US
