Suggerimento Tecnico per la Preparazione del Campione
Livello: Base
Procedure di preparazione del campione biologico
A causa della loro natura, i campioni biologici spesso richiedono una fase di pretrattamento prima dell'estrazione in fase solida (SPE). Ogni matrice pone una spicifica sfida, come la rimozione delle proteine dal plasma e dal siero, la distruzione dei globuli rossi nel sangue intero, l'idrolisi degli analiti glucuronidati nelle urine e l'omogeneizzazione dei campioni di tessuto. Questa nota tecnica delinea le procedure comuni di pretrattamento dei campioni biologici.
Plasma/Siero
I pretrattamenti di plasma e siero sono analita dipendenti. Se l'analita di interesse è un acido, è possibile utilizzare acido fosforico al 2% (20 µl di H3PO4 all'85% in 1 ml di plasma o siero) per interrompere l'interazione farmaco-proteina; invece se l'analita di interesse è basico, è possibile utilizzare idrossido di sodio 0,1 M. Dopo l'aggiunta dell'acido o della base, il campione deve essere agitato su vortex per 20-30 secondi e successivamente centrifugato. ll surnatante recuperato è pronto per le successive analisi.
Sangue intero
Esistono diverse strategie di pretrattamento per la preparazione del sangue intero. Se l'analita target è presente nei globuli rossi, è necessaria una fase di emolisi.
• Emolisi: a 0,2 ml di sangue intero (addizionato con analiti e standard interno) in una provetta da centrifuga da 1,2 ml, aggiungere 400 µl di solfato di zinco al 2% (in metanolo all'80%). Agitare su vortex per 10-20 secondi e centrifugare a 14.000 giri/min per 10 minuti. Raccogliere il surnatante per le successive analisi.
Preparazione di solfato di zinco/metanolo: in un matraccio tarato da 100 mL aggiungere 20 mL di acqua e 3,6 g di ZnSO4 - 7H2O. Aspettare che la soluzione diventi limpida prima di aggiungere metanolo al 100%. Refrigerare la soluzione a 2-8 °C per 7 giorni.
• Rottura osmotica: a 1 ml di sangue intero aggiungere standard interno e 4 ml di acqua distillata. Mescolare/vortexare e lasciare riposare per 5 minuti. Centrifugare a 670 g per 10 minuti ed eliminare il pellet. Regolare il pH del surnatante con l'aggiunta di una soluzione tampone.
• Sonicazione: Sonicare 1 ml di sangue intero per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 3-6 ml di un tampone a pH appropriato (fosfato di potassio). Mescolare/vortexare. Lasciare riposare per 5 minuti. Centrifugare a 670 g per 15 minuti. Recuperare e analizzare il surnatante.
Nota: confrontando le tecniche di pretrattamento sopra indicate per l’estrazione di farmaci acidi, basici e neutri da sangue intero, è stato possibile verificare che i recuperi sono generalmente più elevati quando il campione di sangue intero viene diluito con tampone e sottoposto a denaturazione fisica (sonicazione) anziché mediante l’utilizzo di mezzi chimici. In effetti, il processo di sonicazione distrugge le membrane cellulari, permettendo così recuperi maggiori.1
Saliva
Per i fluidi orali non è richiesta l'idrolisi ed è possibile seguire il protocollo generico utilizzato per il pretrattamento del plasma/siero.
Urina
L'idrolisi enzimatica è necessaria in caso di forme coniugate dell'analita presente (forma solfatata o glucuronidata). L'idrolisi enzimatica richiede pH specifici (pH 4-5) e intervalli di temperatura. È possibile eseguire anche un'idrolisi acida o basica, a seconda della stabilità del composto.
1. Idrolisi enzimatica: a 500 µl di campione (addizionato con analita e standard interno) aggiungere 100 µl di tampone acido (vedere di seguito) e 20 µl di beta-glucoronidasi. Agitare con vortex per 5-6 secondi, incubare a bagnomaria a 63 °C per 30 minuti e trasferire il campione in una piastra di raccolta da 96 pozzetti o in vials. Centrifugare per 10 minuti a 2.000 giri/min.
Preparazione del tampone acido (tampone acetato 1,0 M, pH 4,0): sciogliere 3,0 g di acido acetico glaciale e 4,1 g di acetato di sodio in un matraccio tarato da 1 L.
2. Idrolisi basica: a 1 mL di urina (addizionata con analita e standard interno) aggiungere 100 µL di KOH 10 N. Mescolare con vortex e idrolizzare per 20 minuti a 60 °C. Raffreddare e regolare il pH a 3,5-4,0 (aggiungendo 200 µl di acido acetico glaciale).
3. Idrolisi acida: a 1 ml di urina aggiungere 0,25 ml di HCl in una provetta con tappo a vite. Avvitare leggermente la parte superiore del tubo e scaldare a bagnomaria per 60 minuti. Aggiungere NaOH 1,0 N, per ottenere un pH pari a 7.
Tessuto
Omogeneizzare con solvente organico o acquoso a seconda della solubilità dell'analita. Centrifugare e filtrare il surnatante, prima di eseguire l'estrazione dispersione in fase solida utilizzando terre di diatomee (MSPD).
Riferimento: 1. Chen et al., J. Anal. Toxicol. 1992, v18, pages 352-355
Phenomenex is a technology leader committed to developing novel analytical chemistry solutions that solve the separation and purification challenges of researchers worldwide.
CONNECT WITH US
