Astuce technique HPLC/UHPLC
Niveau : débutant
Le danger d’une incompatibilité de la phase mobile
On peut penser qu’un échantillon élué par SPE est directement prêt à être injecté sur la colonne analytique. Bien que l’échantillon soit effectivement plus propre, il n’est pas nécessairement vrai que l’injection directe sur la colonne se traduira par une chromatographie parfaite. L’incompatibilité de solvant est une cause connue de mauvaise forme de pic, il faut donc prendre en compte la force du solvant utilisée dans l’étape d’élution d’une SPE effectuée sur des échantillons.
Le solvant avec lequel l’échantillon est élué, la concentration globale de l’échantillon et les conditions de phase mobile de la méthode doivent être évalués lors de l’élaboration des protocoles de préparation des échantillons. Une injection dans 100 % de solvant organique lorsque vos conditions initiales de phase mobile présentent une teneur en eau élevée (90 %), peut provoquer une incompatibilité de solvant dans le système, comme illustré dans l’image 1 ci-dessous. Idéalement, un échantillon doit se trouver dans un solvant qui sera proche des conditions initiales de la phase mobile de la méthode LC pour éviter les problèmes de déformation de pic.
Rappelez-vous qu’il n’y a pas de proportion de solvants nécessairement gênants pour votre chromatographie. Un bon exemple de conditions d’élutions favorables est lorsque le produit de précipitation des protéines Phree™ est utilisé pour préparer des échantillons pour une analyse en mode HILIC (chromatographie liquide à interaction hydrophile). Le protocole Phree exige que les échantillons soient dilués selon un rapport de 3: 1 (ratio entre le solvant organique et l’échantillon ) pour l’étape de précipitation des protéines. Le mode HILIC commence à des proportions élevées en acétonitrile, mais nécessite toujours la présence d’eau dans l’échantillon pour obtenir une forme de pic optimale. L’échantillon préparé avec Phree se trouve déjà dans des conditions de solvant idéales pour le mode HILIC et aucun traitement supplémentaire n’est nécessaire, mais si votre analyse utilise l’échange d’ions avec Rezex™, la présence d’acétonitrile dans l’échantillon pourrait causer des problèmes.
Échantillon dans le méthanol à 50 %
Échantillon dans le méthanol à 100 %
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