Suggerimento tecnico HPLC/UHPLC
Livello: Base
Uso del tampone in gradiente
L’eluizione in gradiente è la scelta ideale per analizzare composti con un ampio intervallo di ritenzione sulla fase stazionaria. Per stabilizzare il pH, si usano soluzioni tampone nella fase acquosa, che non sempre sono miscibili nella fase organica. Per questo motivo, il gradiente è soggetto a limitazioni di solubilità e potere tamponante variabile, a causa della variazione nella composizione della fase mobile. Questo limite può essere superato utilizzando un tampone solubile nelle due fasi mobili, come mostrato nei seguenti approcci ed esempi.
Cosa ne pensi di aggiungere alle fasi mobili sia “deboli” che “forti” un additivo acido o basico, come l’acido formico (HCO2H) allo 0,1% (v/v)?
L’aggiunta di un modificante come l’acido formico (HCO2H) allo 0,1% (v/v), sia nella fase mobile acquosa che in quella organica, manterrà costante la sua concentrazione anche quando il rapporto tra le fasi mobili varierà nel corso del gradiente. Lo svantaggio dell’utilizzo di modificanti di questo tipo risiede nell’elevata volatilità, che si può tradurre in variazioni di pH significative e quindi differenti equilibri di protonazione/ deprotonazione degli analiti. Quando è necessario uno stretto controllo del pH, è consigliabile usare tamponi di sali inorganici a basse concentrazioni (5mM).
I tamponi di formiato di ammonio (NH4HCO2) e acetato di ammonio (NH4CH3CO2) sono i più adatti per metodi in gradiente, perché sono solubili in metanolo e possono essere miscelati anche con alte concentrazioni di acetonitrile. La concentrazione del tampone comunemente consigliata è di 5 - 10 mM in ciascuna fase mobile (acquosa e organica). La Figura 1 mostra l'analisi di micotossine su Kinetex™ Biphenyl con tampone acetato di ammonio 5 mM nelle due componenti della fase mobile.
Nel caso si utilizzino tamponi salini, è preferibile aggiungere una percentuale di tampone al solvente organico forte per mantenere un’adeguata capacità tamponante della miscela eluente. La Figura 2 mostra l'analisi in modalità HILIC di amminoacidi non derivatizzati su Biozen™ Glycan. Il tampone utilizzato è formiato di ammonio 100 mM (pH 3.1) in acqua e acetonitrile in un rapporto 9:1 di solvente / tampone. Le fasi mobili risultanti presentavano ciascuna concentrazioni di formiato di ammonio 10 mM, consentendo al gradiente di mantenere un potere tamponante costante.
Il fluoruro di ammonio (NH4F) è spesso usano in piccole quantità (0,1 – 0,2 mM) nella fase mobile, per generare addotti con il fluoruro [M+F]-in modalità ESI-negativa LC / MS, o per favorire la generazione di ioni [M+H]+ or [M+NH4]+ in modalità ESI positiva. La Figura 3 mostra l'uso di una terza linea solvente (contenente tampone NH4F da 1 mM) che viene mantenuta al 10% costantemente lungo la corsa; garantendo una concentrazione pari a 0,1 mM per tutto il gradiente. Le pompe ternarie e quaternarie sono indicate per questo scopo. I gradienti ternari e quaternari sono sensibili a differenze nel volume di differimento tra strumenti differenti; è per questo suggeribile mantenere un breve tratto di isocratica all’inizio del gradiente per favorire la trasferibilità del metodo.
In gradiente, prestare attenzione alle considerazioni sulla solubilità quando si usano i tamponi bicarbonato di ammonio o, in particolare, i tamponi fosfato. Questi tamponi rischiano di precipitare se miscelati con alte percentuali di solventi organici. Per migliorare la forma del picco, è consigliabile tamponare il campione allo stesso pH della fase mobile. L'utilizzo di un gradiente in cui la fase mobile ha una forza tampone e un valore di pH costante migliorerà in definitiva la riproducibilità del metodo LC.
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