Astuce technique HPLC/UHPLC
Niveau : débutant
Utiliser un tampon en mode gradient
Les gradients HPLC sont un moyen efficace pour l'analyse d'échantillons présentant un mélange d'analytes interagissant plus ou moins fortement avec la phase stationnaire de votre colonne favorite. Les gradients ne sont pas toujours adaptés aux tampons lorsque l'on tente de maintenir un pH spécifique. Si l'ajout de tampon est limité à la phase aqueuse et que la phase organique reste strictement constituée d'un solvant organique, alors le gradient peut être soumis à certaines limites de solubilité, ou bien présenter une force de tampon irrégulière, à mesure que la proportion de phase organique augmente. Une manière de remédier à ce problème est d'ajouter le tampon à la fois dans la phase aqueuse (solvant faible en phase inverse) et la phase organique (solvant fort); nous allons passer en revue certaines approches et exemples.
Pourquoi ne pas ajouter l'addifitif acide ou basique, comme l'acide formique (HCO2H) à 0,1% (v/v), à la fois dans les phases mobiles "faibles" et "fortes" ?
Cet ajout dans les deux phases mobiles maintiendra un niveau constant de l'additif lors de l'analyse avec un gradient. L'inconvénient de procéder à ce type d'ajout est que l'additif peut être enclin à se volatiliser du mélange de phases mobiles, et donc générer une force de protonation ou de déprotonation irrégulière vis-à-vis des analytes. Une alternative est d'utiliser un vrai tampon, en utilisant bien le sel approprié pour un additif spécifique, ainsi le pH sera maintenu constant de manière très précise et le risque de volatilisation de l'additif est éliminé.
Les tampons formiate d'ammonium et acétate d'ammonium sont ceux qui se prêtent le mieux aux gradients, car ils sont solubles dans le méthanol, et les tampons aqueux correspondants peuvent être mélangés à de fortes proportions d'acétonitrile. La force du tampon n'est généralement que de 5-10mM dan chaque phase mobile, mais est à comparer à une méthode isocratique 60:40 "tampon 20mM/acétonitrile" pour laquelle la concentration de tampon relative à la phase mobile totale est de 12 mM. La figure 1 présente une analyse des mycotoxines en utilisant une colonne Kinetex™ Biphenyl et un tampon acétate d'ammonium de 5 mM présent à la fois dans la phase mobile aqueuse et le méthanol. Ce tampon a été directement dissous dans le méthanol.
L'acétonitrile devra être mélangé à un tampon aqueux de réactifs tampons communs pour maintenir la solubilité du sel tampon. La figure 2 présente l'analyse, en mode HILIC, d'acides aminés non dérivés avec la Biozen™ Glycan. Un tampon de 100 mM de formiate d'ammonium (pH 3,1) a été ajouté à l'eau et l'acétonitrile dans un rapport solvant/tampon de 9:1. Les phases mobiles qui en résultent présentent chacune des concentrations globales de 10 mM de formiate d'ammonium, ce qui permet au gradient de maintenir un pouvoir tampon global constant.
De petites quantités (0,1 - 0,2 mM) de fluorure d'ammonium (NH4F) sont souvent incluses dans la phase mobile pour générer des adduits fluorés hautement sensibles [M+F]- en mode LC/MS négatif, ou pour encourager la génération d'ions [M+H]+ ou [M+NH4]+ en mode ESI positif. La figure 3 montre l'utilisation d'une troisième voie de solvant par laquelle un tampon NH4F de 1 mM est délivré de manière continue, représentant une proportion de 10% de la phase mobile totale, soit 0,1mM tout au long du gradient. Les pompes ternaires et quaternaires facilitent cette méthode, mais un palier isocratique initial est recommandé au début de la méthode pour tenir compte de la transférabilité de la méthode entre instruments. En effet, Les gradients ternaires et quaternaires sont soumis à des volumes de délaiqui sont spécifiques à chaque instrument, et peuvent être une source de perturbation même lorsque l'une des lignes de solvant est maintenue à un pourcentage constant.
Faites attention à la solubilité lorsque vous incorporer un tampon bicarbonate d'ammonium ou phosphate dans un gradient, surtout avec un tampon phosphate. En effet, il y a risque de précipitation lorsqu'ils sont mélangés avec des proportions élevées de solvant organique. Il est alors recommandé de faire une étude de solubilité. Enfin, n'oubliez pas d'inclure le tampon de votre phase mobile à votre solvant d'injection, pour aligner le pH de l'échantillon avec celui de la phase mobile. Cela vous permettra d'obtenir une meilleure forme de pic et une meilleure reproductibilité. L’utilisation d’un gradient dans lequel la phase mobile a une force tampon et une valeur de pH constantes améliorera la reproductibilité de votre méthode LC.
Kinetex , Luna et Biozen appartiennent à Phenomenex.
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