HPLC/UHPLC Technischer Tipp
Niveau: Grundlagen
Die Auswirkungen des Gradienten auf die Pufferkapazität
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HPLC-Gradienten sind ein wunderbares Mittel zur Analyse einer Probe, bei der die Analyten eine deutlich unterschiedliche Retentivität auf der stationären Phase Ihrer bevorzugten Säule aufweisen. Wenn Sie einen Puffern einsetzen, um einen bestimmten pH-Wert konstant zu halten, kann das bei Gradienten zu verschiedenen Problemen führen. Wenn der Puffer nur in der wässrigen mobilen Phase gelöst ist, während die organische mobile Phase ausschließlich ein organisches Lösungsmittel bleibt, dann kann es bei dem Gradienten zu Löslichkeitseinschränkungen und eine sich ändernde Pufferstärke kommen, wenn der Anteil des organischen Lösungsmittels während des Gradienten zunimmt. Dies kann durch eine gleichmäßige Verteilung des Puffers sowohl auf die "schwache" als auch auf die "starke" mobile Phase bei Ihrer Methode verhindert werden, wofür wir einige Lösungsansätze und Beispiele betrachten werden.
Wie wäre es, wenn man sowohl die "schwache" als auch die "starke" mobile Phase mit einem sauren oder basischen Zusatz wie z.B. 0,1% (v/v) Ameisensäure (HCO2H) versetzt?
Die Zugabe in beide mobile Phasen hält idealerweise die Konzentration des Additivs in der gesamten mobilen Phase konstant, wohingegen sich das Verhältnis von "schwacher" und "starker" mobiler Phase während des Gradienten ändert. Die Nachteile einer solchen Zugabe bestehen darin, dass flüchtige Zusatzstoff aus dem Mobilphasengemisch verdampfen können, was gleichzeitig zu einer Änderung der Protonierung oder Deprotonierung des Analyten führen kann. Vielleicht müssen einige von uns auch zugeben, dass sie bei der (v/v)-Zugabe des Additivs nicht an jedem Tag so präzise waren wie benötigt und gewünscht. Deshalb ist es anzuraten, einen geeigneten Puffer mit dem entsprechenden Salz für den verwendeten Zusatz einzusetzen. Dieser hält den eingestellten pH-Wert konstant, ohne das Risiko, dass sich der Zusatzstoff verflüchtigt.
Ammoniumformiat (NH4HCO2)- und Ammoniumacetat (NH4CH3CO2)-Puffer sind bei Gradientenmethoden am geeignetsten, da diese Salze in Methanol löslich sind, während die entsprechenden wässrigen Puffer mit hohen Acetonitrilanteilen gemischt werden können. Die erforderliche Pufferstärke beträgt typischerweise nur 5 - 10 mM in jeder mobilen Phase, aber im Vergleich dazu beträgt die Pufferkonzentration relativ zur gesamten mobilen Phase einer isokratischen Methode mit 60:40 "20 mM Puffer"/Acetonitril effektiv nur 12 mM. Abbildung 1 zeigt eine Analyse von Mykotoxinen auf einer Kinetex™ Biphenyl mit 5 mM Ammoniumacetat-Puffer, der sowohl die wässrige als auch die Methanol-Mobilphase umfasst, wobei das Ammoniumacetat direkt im Methanol gelöst wurde.
Acetonitril muss mit einem wässrigen Puffer aus üblichen Pufferreagenzien gemischt werden, um die Löslichkeit des Puffersalzes zu erhalten. Abbildung 2 zeigt die Analyse von unterivatisierten Aminosäuren im HILIC-Modus mittels einer Biozen™ Glycan -Säule. Die Stammlösung eines 100 mM Ammoniumformiat-Puffers (pH 3,1) wurde entweder mit Wasser oder Acetonitril in einem Verhältnis von 9:1 Lösungsmittel/Puffer gemischt. Die resultierenden mobilen Phasen wiesen jeweils Gesamtpufferkonzentrationen von 10 mM Ammoniumformiat auf, so dass beim Gradienten eine konstante Gesamtpufferstärke aufrechterhalten Werden konnte.
Ammoniumfluorid (NH4F) wird oft in kleinen Mengen (0,1 - 0,2 mM) in die gesamte mobile Phase zugegeben, um hochempfindliche Fluoridaddukte [M+F]- im ESI-negativ Modus des LC-MS zu erzeugen, oder um die Erzeugung von entweder [M+H]+ oder [M+NH4]+ Ionen im ESI-positiv Modus zu fördern. Abbildung 3 zeigt die Verwendung einer dritten Lösungsmittelleitung, durch die ein 1 mM NH4F Puffer konstant in einem Verhältnis von 10% der gesamten mobilen Phase zudosiert wird, was 0,1 mM in der gesamten mobilen Phase über die gesamte Gradientenlaufzeit entspricht. Ternäre und quaternäre Pumpen erleichtern diese Methode, aber ein anfänglicher isokratischer Halt wird zu Beginn der Methode empfohlen, um der Übertragbarkeit der Methode zwischen den Instrumenten zu erlauben. Ternäre und quaternäre Gradienten werden durch das Verweilvolumen beeinflusst, welches für jedes Instrument spezifisch ist und selbst dann ein Problem darstellen kann, wenn eines der Lösungsmittel auf einem konstanten Prozentsatz des Gesamtgradienten gehalten wird.
Achten Sie auf die Löslichkeit, wenn Sie versuchen, entweder Ammoniumbicarbonatpuffer oder Phosphatpuffer in einen Gradienten zu verwenden, insbesondere wenn Sie mit Phosphatpuffern arbeiten. Bei diesen Puffern besteht die Gefahr des Ausfallens, wenn sie mit hohen Anteilen organischer Lösungsmittel gemischt werden, weshalb eine Löslichkeitsstudie empfohlen wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie den für die mobile Phase vorgesehenen Puffer auch als Teil des Probenlösungsmittels verwenden, um das Injektionslösungsmittel dem pH-Wert der mobilen Phase anzupassen, was der Peakform und Reproduzierbarkeit zugute kommt. Die Verwendung eines Gradienten, bei dem die mobile Phase eine einheitliche Pufferstärke und einen einheitlichen pH-Wert aufweist, verbessert letztlich die Reproduzierbarkeit der LC-Methode.
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