W tym miesiącu w poradniku technicznym przyjrzymy się zagadnieniu kondycjonowania i/lub aktywacji kolumn.
WSZYSTKIE kolumny HPLC firmy Phenomenex poddawane są testom kontroli jakości przed wysyłką. Następnie kolumna jest zalewana rozpuszczalnikiem transportowym, który jest taki sam jak rozpuszczalnik użyty podczas testów, chyba że określono inaczej w dokumencie dostarczanym wraz z kolumną. „Kondycjonowanie kolumny” lub „aktywacja” to terminy, które są często używane zamiennie. Mówiąc prościej, są to czynności podejmowane w celu zmiany rozpuszczalnika kolumny z jej rozpuszczalnika transportowego na mieszaninę rozpuszczalników wykorzystywaną w określonej metodzie analitycznej.
Rozważając, jakie kondycjonowanie jest wymagane, należy zwrócić uwagę na:
Należy rozważyć następujące kwestie:
Podczas pracy z kolumnami z odwróconą fazą, które są zazwyczaj dostarczane w rozpuszczalniku w proporcji 65:35 (acetonitryl:woda) i są głównie używane z mieszaninami metanolu lub acetonitrylu z wodą lub buforem, często możliwe jest przejście bezpośrednio do planowanej fazy ruchomej. Jeżeli stężenie buforu jest wyższe niż 20 mM, może być konieczne przejście przez etap pośredni zawierający mieszalnik organiczny i wodę w odpowiedniej proporcji,a dopiero w następnym etapie wprowadzenie buforu jako części wodnej. Ma to na celu zmniejszenie ryzyka wytrącania się soli.
Niewielka liczba faz stacjonarnych (cyjanowe, aminowe, diolowe) może być stosowana w fazie normalnej lub odwróconej. Są one zazwyczaj dostarczane w mieszaninach faz normalnych, a jeśli mają być użyte w fazach odwróconych, wymagane jest przejście z wykorzystaniem rozpuszczalnika o mieszalności zarówno z rozpuszczalnikami NP jak i RP. Do powyższej czynności można zastosować protokół jak poniższy:
W tym procesie głównym zadaniem THF lub IPA jest usunięcia heksanu z kolumny. Jest to niezwykle ważne, gdyż heksan nie miesza się z metanolem ani z wodą. W kolejnym etapie metanol zastąpi THF lub IPA w kolumnie przed wprowadzeniem fazy ruchomej. Przy wyborze pomiędzy THF a IPA należy zwrócić uwagę na system HPLC. Jeśli przewody systemu lub złączki są wykonane z PEEK, nie można użyć THF i dlatego preferowany jest IPA. Jeśli układ jest wykonany ze stali nierdzewnej, można użyć THF lub IPA, przy czym THF ma tę zaletę, że ma niższą lepkość.
Podczas kondycjonowania kolumny do użytku w układzie gradientowym dobrą praktyką jest przepłukiwanie kolumny silnym rozpuszczalnikiem (zazwyczaj rozpuszczalnikiem B) przed wykondycjonowaniem kolumny w punkcie początkowym gradientu. Pomoże to zapewnić, że kolumna da dobrą linię podstawową, gdy gradient zostanie uruchomiony. Dobrym pomysłem jest również przeprowadzenie dwóch lub trzech pustych gradientów przed nastrzykiem wzorca lub próbki.
Często pojawia się pytanie: „Skąd mam wiedzieć, że kondycjonowanie mojej kolumny zostało w pełni wykonane?”. Istnieją dwa praktyczne sposoby na sprawdzenie czy kolumna jest gotowa.