Nel suggerimento tecnico di questo mese vedremo che cosa si intende per attivazione e/o condizionamento della colonna.
Tutte le colonne HPLC Phenomenex sono testate (QC) prima della spedizione e lasciate nello stesso solvente utilizzato per il test, salvo diversa indicazione riportata sul documento CQA inviato inieme alla colonna. Attivazione e condizionamento sono termini spesso usati in modo intercambiabile. In parole povere, si tratta di uno step necessario a cambiare il solvente di spedizione con la coppia solventi utilizzata in uno specifico metodo analitico.
Nella fase di condizionamento, è necessario prestare attenzione a:
È necessario porsi le seguenti domande:
Quando si lavora con colonne in fase inversa, che in genere sono spedite in acetonitrile:acqua 65:35 e che poi sono utilizzate con miscele di metanolo/ acetonitrile in presenza di acqua o tampone, è possibile passare direttamente alla fase mobile desiderata. Se le concentrazioni del tampone sono superiori a 20 mM, allora potrebbe essere necessario modificare il rapporto organico/acqua prima di tamponare la soluzione al fine di ridurre eventuali rischi di precipitazione di sali.
In fase normale è possibile utilizzare un numero ridotto di fasi stazionarie (ciano, ammino, diolica). Tali fasi stazionarie sono spedite in miscele tipiche della fase normale e, nel caso debbano essere utilizzate in fase inversa, è necessario effettuare il cambio con un solvente universalmente miscibile, secondo il seguente protocollo:
Il THF o l’IPA sono utilizzati per rimuovere l’esano dalla colonna. Lo step è necessario perché l’esano non è miscibile con il metanolo o l’acqua. Il metanolo sostituirà quindi il THF o l’IPA nella colonna prima che venga introdotta la fase mobile. Per scegliere tra THF o IPA è necessario considerare il sistema HPLC. Se i tubi o i raccordi del sistema sono realizzati in PEEK, allora non è possibile usare il THF e si deve preferire l’IPA. Se la fluidica del sistema è costituita da capillari in acciaio inox allora è possibile usare l’IPA o il THF; quest’ultimo ha il vantaggio di avere un viscosità inferiore.
Quando si condiziona una colonna per metodi in gradiente, è buona prassi flussare la colonna con il solvente forte (generalmente solvente B) prima di portare la colonna nelle condizioni iniziali del gradiente. Questo aiuterà a garantire una linea di base stabile nonostante si lavori in gradiente. Inoltre, è consigliato eseguire due o tre bianchi prima di iniettare uno standard di riferimento.
La domanda sorge spontanea: “come so che la mia colonna è completamente condizionata?” Ci sono due modi utili per verificarlo.