Dans les conseils techniques de ce mois-ci, nous allons examiner ce que l'on entend par conditionnement de la colonne HPLC.
Toutes les colonnes HPLC de Phenomenex font l'objet d'un test QC avant l'expédition ; puis elle sont expédiées dans un « solvant d'expédition » qui est généralement le même que le solvant de test, sauf si cela est spécifié dans le document CQA qui accompagne la colonne. « Conditionnement de la colonne » ou « activation » sont des termes souvent utilisés de manière interchangeable. En termes simples, il s'agit des mesures prises pour faire passer une colonne de son solvant d'expédition au système de solvant utilisé dans une méthode d'analyse spécifique.
Avant de procéder au conditionnement de la colonne, il convient de prêter attention aux points suivants :
Les questions suivantes doivent être prises en compte :
Lorsque l'on travaille avec des colonnes de phase inverse, celles-ci sont généralement expédiées dans un mélange acétonitrile:eau 65:35. Les solvants utilisés dans les méthodes HPLC sont généralement des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau ou un tampon, il est donc souvent possible de passer directement à la phase mobile prévue. Si les concentrations en tampon sont supérieures à 20 mM, il peut être nécessaire de passer d'abord un mélange de solvants organique/eau avant d'introduire le tampon pour réduire tout risque de précipitation de sel.
Un petit nombre de phases stationnaires (cyano, amino, diol) peuvent être utilisées à la fois en phase normale ou en phase inverse. Elles sont généralement expédiées dans des mélanges de solvants de phase normale. Si elles doivent être utilisées en phase inverse, il faut effectuer un changement de solvant, et passer d’abord par un solvant universellement miscible ; dans ce cas le protocole suivant peut être utilisé :
Dans ce procédé, le THF ou l'IPA est d'abord utilisé pour éliminer l'hexane de la colonne. Cette étape est importante, car l'hexane ne se mélange pas avec le méthanol ou l'eau. Le méthanol remplacera alors le THF ou l'IPA dans la colonne avant l'introduction de la phase mobile. Lors du choix entre le THF et l'IPA, il faut tenir compte du système HPLC. Si les tubes ou les raccords du système sont en PEEK, le THF ne peut pas être utilisé, il faut donc préférer l'IPA. Si le système utilise des raccords en acier inoxydable, on peut utiliser du THF ou de l'IPA, le THF ayant l'avantage d'avoir une viscosité plus faible.
Lorsqu'on conditionne une colonne pour l'utiliser en mode gradient, il est bon de rincer la colonne avec le solvant fort (généralement le solvant B) avant d'équilibrer la colonne avec les conditions initiales de gradient. Cela permettra de s'assurer d’une ligne de base stable lors de l'exécution du gradient. Il est également judicieux d'effectuer deux ou trois gradients à blanc avant d'injecter des standards.
La question qui se pose souvent est la suivante : « Comment puis-je savoir si ma colonne est parfaitement conditionnée ? ». Il est possible d’utiliser ces deux moyens :
